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La méthode PCR


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A remettre dans le contexte. Combien de T4 sont produits d'habitude ? Et surtout, ça m'étonnerais que ça multiplie par mille ou dix-mille la quantité de particules dans le sang. Or, c'est bien des mu

Donc, aucun problème avec la méthode PCR

Ce n'est pas la méthode qui pèche mais comment tu l'utilise pour détecter quoi avec quelles amorces. Je me répète encore et encore.

Et à toutes les étapes du truc, il n'y a aucun problème ou si peu.

Tout est question de mise au point.

Et tu dis que tes expériences montrent que ce que tu obtiens est forcément une chose virale, puisque on ne retrouve pas dans l'échantillon de controle, ce qu'on trouve dans l'échantillon ou est sensé être le virus.

Après PCR (avant RT) j'obtiens un produit avec une taille qui pour supposer qu'un virus ou autre est présent doit correspondre à une taille précise que j'ai déterminée avec mes deux amorces. Ensuit epour confirmer si c'est le virus que je cherche , je séquence le produit PCR et je le compare avec mes séquences de références. Donc non le PCR ne me permet pas d'affirmer que c'est du virus, il faut entre autre séquencer le produit PCR.

Et comme les virologues ont des méthodes standardisées et que ce sont des gens sérieux

Comme dans toutes les professions, tu as de tout.

la même chose a été faite pour le VIH et est même faite quasi quotidiennement pour l'étudier.

Ben au moins pour étuider sa variabilité j'imagine ! Ce n'est pas parce ce que le virus serait endogène ou autre qu'il ne peut pas être détecté ou séquencé.

Seulement voilà, pour le VIH, on sait qu'il y a des gens qui ont une charge virale, alors qu'il n'ont aucune raison d'avoir le "virus" en eux.

pas super convaincant le "aucune raison d'avoir", évite de supposer.

Donc, puisque, selon toi, la méthode PCR est super spécifique

De ce que tu cherches oui mais si ce que tu cherches n'est pas ce que tu crois......

Problème : la chose en question est clairement un élément endogène puisque des gens qui ne sont clairement pas en contact avec le "virus", possèdent cette chose dans leur sang

Et alors où est le défaut de la PCR, elle ne fait que détecter ce que tu cherches avec les amorces voulues. C'est un peu comme accuser son ordi de ne pas marcher ou de planter , c'est pourtant tout le temps la faute de l'utilisateur non icon_smile.gif ?

sa présence est du coup liée aux conditions dans lesquelles vivent les cellules. Donc, lors de l'étape 1, celle où on cultive les cellules, si les conditions de culture sont les mêmes, normalement, on devrait retrouver des particules, aussi bien dans la culture du "virus", que dans la culture de controle (sans "virus"). Or, d'après ce que tu dis, ça n'arrive apparemment pas.

Pige pas trop.

Donc, soit il y a un problème dans la méthode PCR, soit dans le protocole de l'expérience, soit dans la façon d'appliquer le protocole ou un des deux ou les trois.

....ou simplement on n'identifie pas ce que l'on croit !

Eh oui, les 3 étapes (culture de cellule, broyat, et mesure PCR sur la population) étant liées, il suffit qu'une seule montre que la particule recherchée est endogène pour que les deux autres étapes soient invalidées en tant que preuve d'un agent exogène viral.

Ce n'est pas parce que c'est endogène que ce n'est pas délètère ou que ce soit un marqueur de maladie ou les conséquences de la maladie. Ensuite le vih peut se propager et il peut être une entité infectieuse exogène à part entière.

Tant qu'on reste dans les labos avec des gens qui peuvent soutenir que tout va bien madame la marquise et qu'il n'y a aucun défaut à la méthode, difficile de savoir ce qu'il en est. Mais, avec la troisième étape, ce biais disparait, et on peut voir que les méthode décrites comme correctes sont loin de l'être.

En core une fois tu utilises une méthode pour savoir si quelque chose est présent ou non, tu l'utilises correctement ou non. Tu peux truquer des images, des vidéos, est ce pour cela que les logiciels utilisés pour le faire sont mauvais ???????

Bref, ça m'étonnerais beaucoup que tes expériences soient si nickel que ça.

4-ptdrasrpt.gif Affirmation gratuite, non fondée, n'engageant que toi et ne concernant donc que toi. Bref un peu inutile quoi.

Dans tout ça, ce qui pourrait être sauvé, paradoxalement, c'est la méthode PCR.

4-bravo.gif YEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEES tu aurais compris ce que je voulais dire.

Mais, si le protocole ou la façon de l'appliquer a un défaut fatal, alors, le doute est porté sur le reste des méthodes utilisées, dont la méthode PCR.

hum.gif mouais finalement peut être pas tant que ça........

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  • 6 months later...

Tiens, par rapport à ce que j'ai mis samedi dernier dans le topic sur la fiabilité des tests d'ADN, il est clair que c'est complètement en liaison avec la validité de la méthode PCR. Et il est clair que si la méthode pour identifier l'ADN est en pratique complètement bidonnée (via retouche logicielle), alors, d'une façon générale, la méthode PCR s'effondre avec la méthode d'identification de l'ADN, puisque aucun résultat donné par la méthode PCR ne peut être identifié sérieusement.

http://www.onnouscachetout.com/forum/viewtopic.php?p=248524

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  • 1 month later...

Un autre problème est celui de la séquence d'ADN utilisée pour la PCR et l'identification de cette séquence.

En fait, si je comprends bien, a priori, on doit avoir la séquence qui est créée et identifiée en amont de la réalisation de la PCR. On doit créer une séquence synthétique d'ADN. et, quand on fait la PCR, on n'identifie pas la séquence à la fin de la PCR. Parce qu'on doit la "voir" par une autre méthode (fluorescence par exemple). On doit se contenter de la localiser.

Si c'est bien le cas, alors, le problème de l'identification de l'ADN se pose une seule fois, lors de la création de la séquence synthétique. Et la vérification de cette séquence aussi se fait une seule fois. Ce qui fait que si cette séquence est bidon, on ne peut pas le vérifier après. Or, comme vu sur ce topic, l'identification des séquences d'ADN a tout du bidonnage complet. Donc, en l'absence de vérification, les possibilités de truande de l'ADN synthétique sont énormes. Surtout que la création de l'ADN synthétique se fait dans les laboratoires pharmaeutiques. Donc, pas chez des gens qu'on pourrait qualifier d'indépendants et d'honnêtes.

Et du coup, on ne s'étonne pas que les biologistes ne trouvent pas de résultats divergeants lorsqu'ils analysent l'ADN. Tout simplement parce qu'ils ne l'analysent pas.

Probablement que, parfois, ils l'analysent. Mais ça doit être fait pour des recherches particulières (analyses de mutation de l'ADN par exemple). Ca ne doit pas être fait souvent.

Et dans ce cas, la méthode PCR serait vraiment le meilleur moyen pour truander l'analyse de l'ADN.

Bon, alors bien sur, il est possible que ça ne se passe pas comme ça et qu'une analyse de l'ADN soit faite lors de chaque PCR. Seulement, lors de mes lectures sur la méthode PCR, la partie analyse de l'ADN n'est en général pas évoquée. Donc, on peut penser que c'est parce qu'il n'y a pas d'analyse qui est faite et que ça se passe comme je l'ai dit.

D'ailleurs, quand j'ai posé la question de l'identification de l'ADN à la fin de la PCR, ici et ailleurs, à chaque fois, j'avais l'impression qu'on me répondait à coté, qu'on éludait le problème et qu'on me disait que la réponse se situait au départ de la procédure. Ce qui irait, là aussi, dans le sens de ce que j'ai dit dans ce message.

Modifié par aixur
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Qu'on continue sur des bases claires : aucun intérêt de parler de ces techniques si on part du principe que tout est truandé par celui qui interprête ou qui fait la manip puisqu'évidemment dans ce cas, toute technique est bonne pour la poubelle. Que la manip ne soit pas au point, difficile à interprêter ou autre c'est différent. Je parlerai donc maintenant de la technique en considérant ce point rempli.

En fait, si je comprends bien, a priori, on doit avoir la séquence qui est créée et identifiée en amont de la réalisation de la PCR. On doit créer une séquence synthétique d'ADN. et, quand on fait la PCR, on n'identifie pas la séquence à la fin de la PCR. Parce qu'on doit la "voir" par une autre méthode (fluorescence par exemple). On doit se contenter de la localiser.

? Pour faire une PCR classique tu as besoin de 2 amorces qui encadrent la séquence à analyser et permettent de commencer la PCR , tu dois donc connaitre et faire fabriquer 2 petites séquences, 1 "amont" et 1 en "aval".

Une fois ta PCR faite, si tu veux connaitre sa séquence alors tu utilises un kit qui permet, avec une amorce qui hybride d'un côté du double brin de PCR, de faire un ADN simple brin qui comporte des bases marquées avec un fluorochrome différent en fonctino des quatre bases A, T G C, c'est ensuite lu et tu détermines l'enchainement des bases. Pas de place donc au bidouillage, tu obtiens une séquence point.

Si c'est bien le cas, alors, le problème de l'identification de l'ADN se pose une seule fois, lors de la création de la séquence synthétique. Et la vérification de cette séquence aussi se fait une seule fois. Ce qui fait que si cette séquence est bidon, on ne peut pas le vérifier après. Or, comme vu sur ce topic, l'identification des séquences d'ADN a tout du bidonnage complet. Donc, en l'absence de vérification, les possibilités de truande de l'ADN synthétique sont énormes. Surtout que la création de l'ADN synthétique se fait dans les laboratoires pharmaeutiques. Donc, pas chez des gens qu'on pourrait qualifier d'indépendants et d'honnêtes.

Je n'ai lu qu'en diagonale le topic (je le ferai cependant) mais de ce que j eme rappèle, ils ne séquençait, ils faisaient des PCR pour amplifier des fragmenst de longueurs différentes, c'est très différent de l'obtention d'une séquence. Quant aux amorces fabriquées par les labo pharma, mais où donc as tu vu cela ???????? Il y a des sociétés spécialisées pour ça (eurogentec etc....)

Et dans ce cas, la méthode PCR serait vraiment le meilleur moyen pour truander l'analyse de l'ADN.

Bon, alors bien sur, il est possible que ça ne se passe pas comme ça et qu'une analyse de l'ADN soit faite lors de chaque PCR. Seulement, lors de mes lectures sur la méthode PCR, la partie analyse de l'ADN n'est en général pas évoquée. Donc, on peut penser que c'est parce qu'il n'y a pas d'analyse qui est faite et que ça se passe comme je l'ai dit.

D'ailleurs, quand j'ai posé la question de l'identification de l'ADN à la fin de la PCR, ici et ailleurs, à chaque fois, j'avais l'impression qu'on me répondait à coté, qu'on éludait le problème et qu'on me disait que la réponse se situait au départ de la procédure. Ce qui irait, là aussi, dans le sens de ce que j'ai dit dans ce message.

Ne fait pas l'amalgamme avec l'autre topic, les objectifs sont différents : l'un pour savoir la taille d'une séquence, d'un gène ou autre, et l'auyre pour connaitre la séquence précisément (identification de mutations, pathogènes, souches etc....). Ici , j'ai l'impression que tu parles de PCR pour identifier un nouveau pathogèen par exemple et qu'on ne connait pas sa séquence, dans ce cas, plusieurs techniques sont employées pour orienter vers les amorces à utiliser. De plus, une fois le pathogène identifier par micorscopie ou autre, ils possèdent dez séquences conservées donc on peut les utiliser pour séquencer ce qu'on ne connait pas et sinon on tatonne avec des amorces dites dégénérées (elles comportent une séquence définie et aussi des bases aléatoires) ou on cherche la digestion par des enzymes etc....

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  • 6 months later...

Ouai, en fait, comme je le pensais lors du dernier message, la question de la validité de la pcr est reportée sur le problème de la validité des amorces. Mais (ce que je n'avais pas évoqué la dernière fois), elle est aussi reportée sur le problème de la validité du séquençage.

Donc, quelque part, l'analyse de la méthode pcr n'est qu'une étape dans le problème en question. Le problème se reporte in fine sur le séquençage de l'adn (qui intervient aussi dans la vérification des amorces).

Toutefois, je crois avoir compris ce qu'est réellement la méthode pcr et pourquoi elle donne ce genre de résultats. Donc, j'ai quelques éléments qui, quoiqu'ils ne donnent pas la preuve que la méthode est bidon, expliquent ce qui se passe réellement.

A mon avis, ce qui se passe lors de la pcr, c'est simplement une agrégation de particules entre elles. C'est bien une polymérisation, comme le dit l'orthodoxie, mais pas une polymérisation ordonnée de nucléotides le long d'un brin d'adn. C'est une polymérisation de particules de taille inférieure à celle de l'agrégation obtenue à la fin (ce que l'orthodoxie pense être un brin d'adn) qui donnent une boule de particules à la fin, une agrégation quoi. C'est une agrégation anarchique et en 3 dimensions. Et c'est une agrégation non spécifique. Il y a un peu de tout qui se colle durant cette réaction.

C'est vrai qu'on obtient des particules de taille voulue à la fin. Donc, on pourrait penser que l'orthodoxie a raison, et que c'est parce qu'on a introduit une amorce et une sonde à la fin qui termine la réaction. Mais en fait, il y a un truc qui fait qu'on obtient ces particules de taille voulue.

Tout repose en fait sur la taille des particules introduites au départ (les amorces) et sur le temps de chauffe (et aussi, la température de chauffage). En fait, avec un temps de chauffe T, et des particules de taille X, on sait qu'avec une polymérisation, on va obtenir des particules de taille X+b à la fin du temps de chauffe T (à une température Y). Donc, il suffit de chauffer un temps donné, à une température donnée, en ayant introduit des particules de taille donnée pour obtenir les particules de la taille désirée (ce qu'on pense être les brins d'adn) à la fin. Particules qui seront plus grosses que celles introduites au départ. Bien sur, on chauffe pendant très peu de temps, pour ne pas avoir des particules de taille très différentes.

C'est pour ça que quand on met les particules obtenues sur gel d'électrophorèse pour les séparer par niveau de taille, on obtient bien ce qu'on veut à la taille voulue. Les particules recherchées, marquées par fluorescence, se trouvent bien sur la bonne bande du gel (qui correspond à la taille X+b qu'on voulait obtenir).

Donc, en fait, c'est comme quand on a une pâte qui a tendance à faire des grumeaux. On sait que si on chauffe tant de temps à telle température, il va y avoir des grumeaux de créés. En cuisine, ce n'est pas voulu. Ici, ça l'est. Et on veut controler la réaction pour n'obtenir que des grumeaux de taille voulue.

Bien sur, on pourrait se dire que puisqu'il s'agit d'agrégation, et qu'on multiplie ces dernières en plusieurs étapes, on devrait avoir des boules de plus en plus grosses. Mais en fait, la phase dite de séparation des brins, où on introduit une température plus élevée, doit faire que les particules obtenues se désagrègent. Donc, on repart un peu à zéro à chaque coup.

Alors pourquoi y a-t-il des variations dans la charge virale ? Déjà, en partie, parce que la méthode pcr étant exponentielle et non spécifique, il y a des risques de variations très importantes (d'où le fait que la méthode de la charge virale ne soit pas valable). Mais, à mon avis, comme les amorces se lient de façon non spécifique avec des particules de petite taille (à peu près aussi petites que les amorces), le résultat va dépendre de la quantité de ces particules de petite taille dans la solution. Or, ces particules de petites tailles c'est quoi ? Ce sont des déchets cellulaires. Donc, plus la personne à de déchets cellulaires dans le sang, plus la charge virale risque d'être élevée. Et donc, la charge virale va varier en partie en fonction de la quantité de ces déchets présents dans la solution.

PS : Par contre, par rapport à ce que je disais au début de ce message, pour la charge virale, ce que je disais est valide. On n'analyse pas l'adn obtenu à la fin, ni l'amorce utilisée au départ (on fait confiance à l'entreprise qui l'a vendue). On se fie simplement à la présence plus ou moins grande d'une fluorescence dans la solution finale. Du coup, on ne sait absolument pas ce qui se passe réellement lors de la réaction. Le technicien ne sait rien de ce qui se passe réellement. Il fait juste une mesure de fluorescence à la fin (probablement automatisée). Donc, ça élimine la possibilité qu'un technicien ayant de l'esprit critique vienne remettre en cause la méthode.

Modifié par aixur
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C'est étonnant cet acharnement à vouloir démontrer que cette technique est bidon pour justifier qu'un virus n'existe pas. Si le virus n'existe pas alors forcément la technique n'est pas valable !

A mon avis, ce qui se passe lors de la pcr, c'est simplement une agrégation de particules entre elles. C'est bien une polymérisation, comme le dit l'orthodoxie, mais pas une polymérisation ordonnée de nucléotides le long d'un brin d'adn. C'est une polymérisation de particules de taille inférieure à celle de l'agrégation obtenue à la fin (ce que l'orthodoxie pense être un brin d'adn) qui donnent une boule de particules à la fin, une agrégation quoi. C'est une agrégation anarchique et en 3 dimensions. Et c'est une agrégation non spécifique. Il y a un peu de tout qui se colle durant cette réaction.

Absolument pas, impossible, les brins d'ADN produits ne peuvent pas s'agréger sur de longue taille de façon non spécifique, il faut forcément complémentarité des bases entre 2 bins d'ADN. Si la pcr foire, tu obtiens des petits fragments aberrants, mais au séquençage, tu n'obtiendra pas grand chose, juste quelques bases d'ADN lisibles. D'ailleurs même si cela était vrai, j'aimerais bien savoir sur quoi tu te bases pour le prouver !

C'est vrai qu'on obtient des particules de taille voulue à la fin. Donc, on pourrait penser que l'orthodoxie a raison, et que c'est parce qu'on a introduit une amorce et une sonde à la fin qui termine la réaction. Mais en fait, il y a un truc qui fait qu'on obtient ces particules de taille voulue.

La taille n'est qu'un point de validité pour le séquençage, tu peux avoir une bonne taille mais une séquence qui ne correspond à rien.

Tout repose en fait sur la taille des particules introduites au départ (les amorces) et sur le temps de chauffe (et aussi, la température de chauffage). En fait, avec un temps de chauffe T, et des particules de taille X, on sait qu'avec une polymérisation, on va obtenir des particules de taille X+b à la fin du temps de chauffe T (à une température Y). Donc, il suffit de chauffer un temps donné, à une température donnée, en ayant introduit des particules de taille donnée pour obtenir les particules de la taille désirée (ce qu'on pense être les brins d'adn) à la fin. Particules qui seront plus grosses que celles introduites au départ. Bien sur, on chauffe pendant très peu de temps, pour ne pas avoir des particules de taille très différentes.

La taille de départ n'a pas d'importance en soi pour séquencer, tout dépend de ce que tu cherches, quel gène, quel endroit d'un gèn eetc...c'est toi qui décide du segment à amplifier (et donc de la taille obtenue) avec les amorces. Ensuite, tu te trompes totalement sur l'incidence des différents paramêtres et contrairement à ta pâte et les grumeuax, le plus souvent avec ton séquençage, tu auras soit une bonne séquence, soit rien. Trop de température, pas assez, amorces trop courtes , mal faites, temps de polymérisation trop court, trop long etc... et tu n'obtiendras quasiement rien.

Alors pourquoi y a-t-il des variations dans la charge virale ? Déjà, en partie, parce que la méthode pcr étant exponentielle et non spécifique, il y a des risques de variations très importantes (d'où le fait que la méthode de la charge virale ne soit pas valable).

non, on obtient des résultats très fiables si il n'y a pas de doute au départ sur ce qu'on analyse !

Mais, à mon avis, comme les amorces se lient de façon non spécifique avec des particules de petite taille (à peu près aussi petites que les amorces), le résultat va dépendre de la quantité de ces particules de petite taille dans la solution.

Non, elles sont suffisament longues pour être ultra spéciqiues (au moins 16 nucléotides environ)

le résultat va dépendre de la quantité de ces particules de petite taille dans la solution. Or, ces particules de petites tailles c'est quoi ? Ce sont des déchets cellulaires. Donc, plus la personne à de déchets cellulaires dans le sang, plus la charge virale risque d'être élevée. Et donc, la charge virale va varier en partie en fonction de la quantité de ces déchets présents dans la solution.

donc on ne devrait obtenir à la pcr que des produits de petites tailles, ce qui n'est pas le cas et si ces morceaux s'agrégeaient on devrait avoir toutes les tailles possibles or ce n'est pas le cas.

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(Nico111 @ Jeudi 31 Mai 2007 21h06)

C'est étonnant cet acharnement à vouloir démontrer que cette technique est bidon pour justifier qu'un virus n'existe pas. Si le virus n'existe pas alors forcément la technique n'est pas valable !

Oui, mais comme la technique en question permet d'inventer des résultats, on en vient à être obligé de réfuter carrément la technique en question. En plus, je cherche à aller plus loin que le problème de l'isolement d'un virus. Je cherche à remettre en cause l'identification de l'adn.

Absolument pas, impossible, les brins d'ADN produits ne peuvent pas s'agréger sur de longue taille de façon non spécifique, il faut forcément complémentarité des bases entre 2 bins d'ADN. Si la pcr foire, tu obtiens des petits fragments aberrants, mais au séquençage, tu n'obtiendra pas grand chose, juste quelques bases d'ADN lisibles. D'ailleurs même si cela était vrai, j'aimerais bien savoir sur quoi tu te bases pour le prouver !

Ca, c'est toi qui l'affirme. Il faut le prouver.

Cela dit, c'est vrai que la pcr peut foirer. Si on chauffe trop longtemps ou pas assez, la taille des particules marquées par la fluorescence ne va pas correspondre à la taille attendue. Et si on chauffe trop longtemps, on risque aussi une d'avoir une distribution des bandes plus éparpillée. Donc, effectivement, le séquençage va être plus foireux. Et en plus, comme tu l'évoques plus loin, le séquençage peut s'avérer foireux même si tout semble s'être bien passé.

Cela dit, je ne parlais pas de séquençage dans mon dernier post. Je me limitais à la méthode pcr. Ce que j'ai dit dans mon dernier post ne permet pas de réfuter ou non le problème du séquençage, ni même de la pcr, puisque c'est lié au problème du séquençage (chose que j'ai dite clairement au début de mon message). C'était juste une explication alternative. Pour réfuter ces techniques, c'est la technique du séquençage qu'il faut réfuter.

La taille n'est qu'un point de validité pour le séquençage, tu peux avoir une bonne taille mais une séquence qui ne correspond à rien.

Idem, je ne parlais pas du séquençage. Mais bon, effectivement, effectivement, tu peux avoir une bonne taille et un séquençage foireux. Vu comment est fait le séquençage, ça ne m'étonne pas trop.

La taille de départ n'a pas d'importance en soi pour séquencer, tout dépend de ce que tu cherches, quel gène, quel endroit d'un gèn eetc...c'est toi qui décide du segment à amplifier (et donc de la taille obtenue) avec les amorces.

Apparemment, tu te contredis toi même juste après, puisque tu reconnais qu'une amorce trop courte peut tout faire foirer.

Ensuite, tu te trompes totalement sur l'incidence des différents paramètres et contrairement à ta pâte et les grumeaux, le plus souvent avec ton séquençage, tu auras soit une bonne séquence, soit rien. Trop de température, pas assez, amorces trop courtes , mal faites, temps de polymérisation trop court, trop long etc... et tu n'obtiendras quasiment rien.

Ca va tout à fait dans le sens de ce que je dis. Une température trop chaude, ou pas assez, amorces trop courtes, temps de polymérisation trop court ou trop long font foirer le truc. Parce que les grumeaux attendus ne seront pas à la bonne taille, et verront leur distribution plus éparpillée.

non, on obtient des résultats très fiables si il n'y a pas de doute au départ sur ce qu'on analyse !

Non, on sait que la charge virale peut être très variable sur un même échantillon. Ca, c'est quelque chose de connu. Par ailleurs, en tant que défenseur de l'orthodoxie, tu aurais plutot du mal à venir nous dire que l'adn du vih n'est pas archi-connu. Or, c'est bien sur la charge virale du vih qu'on a des données sur la très grande variabilité des résultats à partir d'un même échantillon sanguin.

donc on ne devrait obtenir à la pcr que des produits de petites tailles, ce qui n'est pas le cas

Ben, on obtient des produits de petites tailles. On ne peut pas dire que les quelques dizaines à centaines de nucléotides, ce soit très long.

et si ces morceaux s'agrégeaient on devrait avoir toutes les tailles possibles or ce n'est pas le cas.

D'où le fait que la température d'agrégation dure très peu de temps. Ca permet d'avoir des agrégations de taille assez similaire. Ca permet d'éviter la dispersion. Je l'ai pourtant déjà dit dans mon post.

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(Nico111 @ Jeudi 31 Mai 2007 21h06)

C'est étonnant cet acharnement à vouloir démontrer que cette technique est bidon pour justifier qu'un virus n'existe pas. Si le virus n'existe pas alors forcément la technique n'est pas valable !

Pour ma part, je ne remets nullement en question la technique du PCR, et en ce sens, je rejoins donc Nico111.

Ceci étant, cette technique ne peut être utilisée pour prétendre détecter une prétendue contamination par le "VIH", au moins pour les deux raisons suivantes.

1) Il faut préalablement avoir prouvé que le matériel génétique utilisé par la technique "PCR" est bien originaire d'un rétrovirus "VIH". Cette preuve n'a jamais été apportée jusqu'à ce jour. Au contraire, ce qui s'est passé, c'est qu'au cours des prétendues isolations de Montagnier en 1983 et de Gallo en 1984, du matériel génétique particulier a été découvert (étant justement celui utilisé par la technique du PCR) et a été prétendument attribué à un rétrovirus "VIH" en se fondant sur trois prétendues "preuves". Or l'analyse de ces trois "preuves" permet de constater que non seulement elles ne sont pas spécifiques des rétrovirus, et encore moins d'un nouveau rétrovirus "VIH", mais pire encore, qu'elles sont affreusement banales et communes (activité de transcriptase inverse, photographies de particules d'apparence rétrovirale dans des cultures [et non dans le gradient de densité spécifique des rétrovirus, soit le gradient 1,16 mg/ml], réaction d'anticorps avec des antigènes dont l'origine est inconnue).

Par conséquent, la circonstance que la PCR puisse réagir positivement ne prouvera en aucune façon que la personne en question a été contaminée par le mythique rétrovirus "VIH" (au mieux, cela pourra-t-il prédire dans certains cas une prédisposition future à développer des maladies particulières, mais il n'y a nul besoin de "VIH" pour l'expliquer). Ce qu'il aurait fallu faire, et c'est justement ce que l'orthodoxie du sida n'a jamais pu faire, c'est isoler à partir d'un malade du sida le supposé rétrovirus "VIH" lui-même de tous les contaminants, prouver qu'il est capable de répliquer, et ensuite seulement déterminer son matériel génétique après l'avoir "mis en pièces" et séquencé. Alors là, l'orthodoxie du sida pourrait affirmer qu'elle a bien isolé un nouveau rétrovirus "VIH" à partir d'un sidéen. Or, c'est le "raisonnement" inverse qui a été suivi : découverte de matériel génétique particulier et attribution de ce matériel (sur base de preuves en réalité inexistantes) à un nouveau rétrovirus "VIH" pourtant jamais isolé à partir de ne fût-ce qu'un seul malade de sida.

2) Pire encore, à supposer même que l'existence du "VIH" aurait pu avoir été prouvée, la découverte de ce matériel génétique particulier chez un malade ne prouvera cependant pas qu'il a été contaminé par le "VIH". Il faut en effet s'assurer de la fiabilité de la technique du PCR en la matière. Or pour s'assurer de cette fiabilité, il faut par définition comparer le résultat obtenu par la technique PCR avec le seul étalon-or admissible, à savoir le "VIH" lui-même, ce qui permettra de s'assurer que la technique utilisée de PCR n'amplifie chez la personne testée que des séquences du "VIH" et rien d'autre. Le "VIH" n'ayant jamais été isolé, un tel étalon-or n'existe pas et il est donc impossible de prétendre que la technique PCR aurait une quelconque fiabilité à détecter une infection par le très hypothétique "VIH".

A cet égard, il est cocasse de noter que la très orthodoxe CDC américaine (que l'on ne peut certainement pas accuser de complaisance à l'égard de la dissidence du sida) déclare elle-même que la PCR ne peut pas être utilisée seule pour détecter une prétendue infection par le "VIH". Elle déclare au contraire que la prétendue contamination par le "VIH" doit d'abord être "confirmée" (LOL) par le test d'anticorps "VIH". Ce n'est que si ce (prétendu) test d'anticorps est positif que la technique PCR pourra être utilisée ensuite pour "confirmer" (LOL) l'infection par le "VIH" et mesure ensuite la prétendue "charge virale" (LOL), l'orthodoxie du sida faisant le pari que dans ce cas de figure, la technique PCR ne ferait qu'amplifier le matériel génétique prétendument attribué au "VIH".

Une exception est toutefois prévue par l'orthodoxie du sida, en ce sens que la détection d'une infection par le "VIH" peut et même doit être détectée par la seule technique du PCR (sans donc faire nécessairement et préalablement appel à la technique des tests d'anticorps) chez (et uniquement) les enfants infectés par la voie périnatale (le test des anticorps n'est pas fiable car il pourrait détecter les anticorps produits par l'organisme de la mère, et non par le bébé, par forcément "contaminé" donc).

Il faudra cependant m'expliquer d'une part, comment la PCR qui est décrite comme spécifique pour détecter les séquences spécifiques d'un rétrovirus exogène "VIH" ne devrait pas être utilisée seule chez les adultes, les adolescents et les enfants "infectés" via le sang, mais est en revanche recommandé et approuvé pour détecter à elle seule la transmission verticale du "VIH" [?!], et, d'autre part, comment la PCR fait-elle la distinction entre les enfants "infectés" par voie périnatale et par les autres moyens [?!] Ces incohérences résultent justement du fait que le seul étalon-or admissible, à savoir le "VIH" lui-même, n'a jamais été isolé.

Conclusion :

A défaut de n'avoir jamais pu isoler le "VIH" à partir de ne fût-ce qu'un seul sidéen, la technique du PCR, seule ou avec d'autres techniques, ne saurait être utilisée pour détecter une prétendue contamination par le "VIH", et un résultat positif obtenu par cette technique ne sera donc JAMAIS la preuve d'une contamination par le "VIH" !

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Oui, mais comme la technique en question permet d'inventer des résultats, on en vient à être obligé de réfuter carrément la technique en question.

Je ne vois pas comment incriminer une technique si le départ est faux, dans ce cas, n'importe quelle technique est invalide appliquée à ce problème , c'est tout ! Tu ne peux cependant pas avec seulement cela remettre en cause cette technique quand elle est appliquée à autre chose.

Ca, c'est toi qui l'affirme. Il faut le prouver.

Lol, trop facile, c'est partout dans les bouquins, les publi et autres et je l'ai expérimenté des tonnes de fois alors, stp l'argument est vraiment falacieux, c'est justement à toi de prouver le contraire (et bon courage !).

La taille de départ n'a pas d'importance en soi pour séquencer, tout dépend de ce que tu cherches, quel gène, quel endroit d'un gèn eetc...c'est toi qui décide du segment à amplifier (et donc de la taille obtenue) avec les amorces.

Apparemment, tu te contredis toi même juste après, puisque tu reconnais qu'une amorce trop courte peut tout faire foirer.

? je ne vois pas où. Bien sur qu'il est important d'avoi rune amorce spécifique......c'est la base même.

Non, on sait que la charge virale peut être très variable sur un même échantillon. Ca, c'est quelque chose de connu. Par ailleurs, en tant que défenseur de l'orthodoxie, tu aurais plutot du mal à venir nous dire que l'adn du vih n'est pas archi-connu. Or, c'est bien sur la charge virale du vih qu'on a des données sur la très grande variabilité des résultats à partir d'un même échantillon sanguin.

Encore une fois tu te bases uniquement sur le problème HIV, pour d'autres virus pas de soucis avec ces types de techniques.

Ben, on obtient des produits de petites tailles. On ne peut pas dire que les quelques dizaines à centaines de nucléotides, ce soit très long.

On ne séquences pas sur aussi court mais sur plusieurs centaines de nucléotides.

et si ces morceaux s'agrégeaient on devrait avoir toutes les tailles possibles or ce n'est pas le cas.

D'où le fait que la température d'agrégation dure très peu de temps. Ca permet d'avoir des agrégations de taille assez similaire. Ca permet d'éviter la dispersion. Je l'ai pourtant déjà dit dans mon post.

???? pour amplifier 1000 paires de bases, il faut en général faire une élongation de 30 secondes à une minute à une temperature déterminée, cette dernière n'influe absolument pas sur la taille des segments d'ADN obtenus, c'est le temps auquel on reste à cette température.

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(Nico111 @ Vendredi 01 Juin 2007 13h09)

Je ne vois pas comment incriminer une technique si le départ est faux, dans ce cas, n'importe quelle technique est invalide appliquée à ce problème , c'est tout ! Tu ne peux cependant pas avec seulement cela remettre en cause cette technique quand elle est appliquée à autre chose.

On peut faire les deux. L'un n'empêche pas l'autre. Ca fait deux arguments au lieu d'un. Par ailleurs, c'est une technique clef dans l'isolement des virus. Et puis, le fait qu'il y ait des variations dans la charge virale à partir d'un même échantillon sanguin va bien dans le sens de l'idée que la technique n'est pas spécifique. Et enfin, comme je te l'ai dit, je vise aussi la critique de l'existence de l'adn. Plein de raisons que me poussent à remettre en cause la pcr. Je ne me limite pas à la problématique du vih.

Lol, trop facile, c'est partout dans les bouquins, les publi et autres et je l'ai expérimenté des tonnes de fois alors, stp l'argument est vraiment falacieux, c'est justement à toi de prouver le contraire (et bon courage !).

Ben justement, si c'est partout dans les bouquins, tu ne devrais avoir aucune difficulté à me donner des preuves. Cela dit, ça ne nous mènerait pas bien loin, vu que comme je l'ai dit, la preuve est reportée sur le séquençage. C'est le séquençage qu'il faut réfuter. Heureusement, depuis deux jours, j'ai une explication alternative sur ce sujet, qui est dérivée de celle que j'ai donnée sur la pcr.

? je ne vois pas où. Bien sur qu'il est important d'avoi rune amorce spécifique......c'est la base même.

Eh oui, effectivement, si on a un truc de départ plus petit, c'est que l'amorce n'est pas spécifique. Effectivement, c'est logique par rapport à l'orthodoxie. Ca lui permet d'expliquer pourquoi il y a erreur si l'amorce est trop petite. Mais bon, ça ne réfute pas ma théorie. Et puis, tu continues à te contredire, puisque, avant tu avais bien dit que la taille de départ n'avait pas d'importance.

Encore une fois tu te bases uniquement sur le problème HIV, pour d'autres virus pas de soucis avec ces types de techniques.

Bien sur, parce que, pour les autres virus, il n'y a pas de dissidence pour mettre le doigt sur le problème. Mais je suis sur que si on calculait la charge virale plusieurs fois sur un même échantillon pour d'autres virus, on obtiendrait le même genre de variabilité.

On ne séquences pas sur aussi court mais sur plusieurs centaines de nucléotides.

Je ne trouve pas que ce soit énorme. On reste à une échelle de taille très petite.

???? pour amplifier 1000 paires de bases, il faut en général faire une élongation de 30 secondes à une minute à une temperature déterminée, cette dernière n'influe absolument pas sur la taille des segments d'ADN obtenus, c'est le temps auquel on reste à cette température.

Ben, c'est exactement ce que je disais. Le temps de chauffe influe sur la longueur de l'agrégation obtenue.

Par ailleurs, ma théorie cadre mieux avec un temps de chauffe aussi court. C'est quand même très bizarre qu'en aussi peu de temps, les nucléotides arrivent à se ranger parfaitement dans le bon ordre le long d'un ruban. Tandis qu'avec ma théorie, ce n'est pas étonnant que des polymères soient capable de s'agréger en grumeaux de façon anarchique pendant ce court temps.

Si la pcr foire, tu obtiens des petits fragments aberrants, mais au séquençage, tu n'obtiendra pas grand chose, juste quelques bases d'ADN lisibles.

Je rebondis là dessus à nouveau. c'est un truc qui m'avait déjà fait tilter. C'est vrai qu'il y a des pcr foireuses. Et qu'est-ce qu'on fait alors ? On recommence la pcr. Bref, on veut obtenir quelque chose de précis (parce qu'on sait ce qu'on veut obtenir), et quand on ne l'obtient pas, on recommence jusqu'à ce qu'on l'obtienne. Ben, forcément, comme ça, c'est sur que souvent, on va finir par obtenir à peu près ce qu'on veut. D'ailleurs, j'aimerais bien savoir le taux de réussite d'une pcr.

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je vise aussi la critique de l'existence de l'adn.

Oula, alors là moi je dis que tu me dépasses, et de très loin, tu ne crois donc pas aux virus, au système immunitaire (soit allez d'accord) et pas à l'ADN ? mais finalement alors peut être qu'on existe pas ? Bref, je te répond sur un sujet que je connais bien mais je ne voi spas trop l'intérêt puisque de toute façon tu n'as jamais tort.

as tu déjà extrait de l'ADN ? As tu crée des séquences de toute pièce, modifié des virus ? As tu déjà fait une pcr, ou alors vu comment on le faisait et les résulats obtenus ?

Ben justement, si c'est partout dans les bouquins, tu ne devrais avoir aucune difficulté à me donner des preuves.

Toujours la même rengaine........cherche un peu, c'est pas dur.

Eh oui, effectivement, si on a un truc de départ plus petit, c'est que l'amorce n'est pas spécifique

?????

Et puis, tu continues à te contredire, puisque, avant tu avais bien dit que la taille de départ n'avait pas d'importance.

? Tu mélanges tout, taille des amorces, taille du fragment amplifié etc....

Bien sur, parce que, pour les autres virus, il n'y a pas de dissidence pour mettre le doigt sur le problème. Mais je suis sur que si on calculait la charge virale plusieurs fois sur un même échantillon pour d'autres virus, on obtiendrait le même genre de variabilité.

Ben voyons, lis donc les publi.

Je ne trouve pas que ce soit énorme. On reste à une échelle de taille très petite.

Et tu es qui pour affimer ça ? lol, j'adore tu me dis "ah oui c'est trop petit", trop bon , ça c'est de l'argument. moi je te dis "les bactéries ç an'existe pas, c'est trop petit pour les voir à l'oeil nu". Extra , est ce que tu te rends compte de la valeur des ces type d'arguments ?

Ben, c'est exactement ce que je disais. Le temps de chauffe influe sur la longueur de l'agrégation obtenue.

non tu parlais de la température. et c'est le temps d'élongation qui influe sur la taille obtenue.

C'est quand même très bizarre qu'en aussi peu de temps, les nucléotides arrivent à se ranger parfaitement dans le bon ordre le long d'un ruban

Ben c'est pareil dans nos chères petites cellules ! et heureusement sinon je ne sais pas comment on vivrait !

Et qu'est-ce qu'on fait alors ? On recommence la pcr. Bref, on veut obtenir quelque chose de précis (parce qu'on sait ce qu'on veut obtenir), et quand on ne l'obtient pas, on recommence jusqu'à ce qu'on l'obtienne.

C'est beau , comme si on était tous des falsificateurs !!! Et bien oui on recommence, et si ça ne marche pas ben on essaye autre chose et si ça ne marche ben on passe à autre chose lol.

D'ailleurs, j'aimerais bien savoir le taux de réussite d'une pcr.

Ca dépend complètement de quoi on fait.

Je crois vraiement que tu devrais essayer de voir un labo de biologie moléculaire.

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  • 7 months later...

De toute façon, il y a moyen de vérifier si la méthode PCR est non spécifique. Là, c'est vrai qu'on ne peut pas vérifier puisqu'on peut supposer que ce qui est mesuré par le test est dans le corps de tous les humains même s'il s'agit d'un ADN non viral.

Mais il suffit de prendre des bactéries par exemple, et prendre un ADN soi-disant propre à un type de bactérie. Et ensuite, essayer de détecter le même ADN dans la culture d'une autre bactérie. Et là, on verra que, surprise ! la méthode PCR, soi-disant ultra spécifique, détecte aussi l'ADN en question chez l'autre bactérie.

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Mais il suffit de prendre des bactéries par exemple, et prendre un ADN soi-disant propre à un type de bactérie. Et ensuite, essayer de détecter le même ADN dans la culture d'une autre bactérie. Et là, on verra que, surprise ! la méthode PCR, soi-disant ultra spécifique, détecte aussi l'ADN en question chez l'autre bactérie.

?????? tu te bases sur quoi pour dire ça ? et ensuite tout dépend ce que tu cherches (une gène, une séquence particulière etc....). Je ne vois aucune preuve ici qui supporte ton affirmation. Si tu veux détecter un gène qui est commun à toutes les bactos quasiement, evidemment que ta PCR sera positive partour et inversemen avec un gène spécifique à certaines. Comme je le disais ailleurs, certains ( rares )gènes de levure ert des hommes sont quasiement identique à plus de 90%il me semble.

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Ben je me base sur tout ce que j'ai dit avant.

Sinon, relis bien ce que j'ai écrit. J'ai écrit "Mais il suffit de prendre des bactéries par exemple, et prendre un ADN soi-disant propre à un type de bactérie". Donc, ta remarque sur le gène commun, etc..., n'a pas d'objet. Je parle d'un truc spécifique à chacune des deux bactéries. Mais on peut prendre deux animaux avec un bout d'ADN sensé être propre à chacun de ces deux animaux.

Je ris d'avance du résultat d'une telle expérience.

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Je ne vois pas en quoi rire est un argument valable pour justifier tes dires. Pour ce qui est du fait de pouvoir amplifier par PCR un gène spécifique chez une bactérie et chez une autre absolument aucun problème, les milliers de chercheurs font ça tout les jours en routine !!!! c'est aussi facile que de détecter un chromosome Y chez un homme et pas chez une femme ! evidemment, je suis tout prêt à examiner une preuve contraire.

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Tiens au pif je prend ça:

Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jun 29;101(26):9786-91. Epub 2004 Jun 22.Click here to read Click here to read Links

Complete genomes of two clinical Staphylococcus aureus strains: evidence for the rapid evolution of virulence and drug resistance.

Staphylococcus aureus is an important nosocomial and community-acquired pathogen. Its genetic plasticity has facilitated the evolution of many virulent and drug-resistant strains, presenting a major and constantly changing clinical challenge. We sequenced the approximately 2.8-Mbp genomes of two disease-causing S. aureus strains isolated from distinct clinical settings: a recent hospital-acquired representative of the epidemic methicillin-resistant S. aureus EMRSA-16 clone (MRSA252), a clinically important and globally prevalent lineage; and a representative of an invasive community-acquired methicillin-susceptible S. aureus clone (MSSA476). A comparative-genomics approach was used to explore the mechanisms of evolution of clinically important S. aureus genomes and to identify regions affecting virulence and drug resistance. The genome sequences of MRSA252 and MSSA476 have a well conserved core region but differ markedly in their accessory genetic elements. MRSA252 is the most genetically diverse S. aureus strain sequenced to date: approximately 6% of the genome is novel compared with other published genomes, and it contains several unique genetic elements. MSSA476 is methicillin-susceptible, but it contains a novel Staphylococcal chromosomal cassette (SCC) mec-like element (designated SCC(476)), which is integrated at the same site on the chromosome as SCCmec elements in MRSA strains but encodes a putative fusidic acid resistance protein. The crucial role that accessory elements play in the rapid evolution of S. aureus is clearly illustrated by comparing the MSSA476 genome with that of an extremely closely related MRSA community-acquired strain; the differential distribution of large mobile elements carrying virulence and drug-resistance determinants may be responsible for the clinically important phenotypic differences in these strains.

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlere...gi?artid=470752

En très gros, ces 2 souches de staph aureus ont été séquencées par PCR et on trouve du commun et aussi des différences dont par exemple cette cassette scc476 qui encoderait une séquence de résistance à l'acide fusidiqu et qui pourrait entre autre expliquer son profil plus invasif ou résistant.

Il en est de même pour les souches qui résistent à l'amoxicilline, on trouve facilement par PCR les gènes correspondant à cette résistance.

Les exemples sont infinis et la PCR est toujours là !

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  • 2 weeks later...

Non, tu ne comprends vraiment pas. Je me demande d'ailleurs comment tu as fait pour obtenir tes diplômes. Parce que vu le bordel que sont certains cours ou polycopiés de cours en fac, et vu ta capacité à comprendre de travers les trucs les plus évidents, je me demande comment tu as fait pour comprendre tes cours et ensuite, réussir tes examens.

Je vais simplifier le truc pour que tu comprennes mieux. Mais, je crois que tu vas encore faire exprès de comprendre de travers.

Je dis que s'il y a deux bactéries 1 et 2, et un bout d'ADN A qu'on ne peut théoriquement trouver que dans la bactérie 1 et pas dans la bactérie 2, avec la méthode PCR, on pourra quand même trouver le bout d'adn A dans la bactérie 2.

Mais bon, ça fait un certain temps que je pense que tu n'es là que pour noyer le poisson.

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Bon, de toute façon, je crois qu'on tient une expérience qui remet en cause la PCR. C'est moins direct que l'expérience que j'ai proposée plus haut, mais à mon avis, c'est quand même une preuve.

Cette expérience, c'est celle dont parle Wallypat sur cette page, où une personne a vu sa charge virale réduite (vers 600) et son taux de cd4 augmenter à 1.200 à la suite d'une prise d'ibuprofen (un anti-inflammatoire léger).

La preuve que la pcr ne mesure pas la quantité d'ADN, mais la quantité de petites particules, c'est le fait qu'avec un anti-inflammatoire stéroidien (cortisone), ou un non stéroidien à faible effet (comme l'ibuprofen), la personne va voir sa charge virale diminuer. Or, la charge virale ne devrait pas diminuer. Jusqu'à nouvel ordre, un anti-inflammatoire ne fait pas baisser la charge virale (ni monter les cd4, mais c'est un autre problème), parce qu'un anti-inflammatoire n'a pas d'action anti-virale. Donc, il devrait y avoir autant d'adn viral qu'avant. Autant, avec une trithérapie, on peut dire que c'est parce que la trithérapie agit bien comme on dit qu'elle agit (action anti-virale). Mais avec un anti-inflammatoire, non.

Bien sur, il y a l'hypothèse dissidente du stress oxydatif. On pourrait me dire qu'il n'y a pas de vih, et que ce qui est mesuré, c'est l'adn des molécules de stress émises par l'être humain. Seulement, jusqu'à nouvel ordre, les anti-inflammatoires ne sont pas supposés lutter contre le stress oxydatif. Donc, là aussi, il y a problème. Surtout qu'il faudrait expliquer le fait qu'un anti-inflammatoire puissant à moins d'effet sur le stress oxydatif qu'un anti-inflammatoire peu puissant. Ce qui est légèrement illogique.

Par contre, avec ma vision des trithérapies (à savoir, que ce sont des simples anti-inflammatoires stéroidien du genre cortisone, ou non stéroidien, mais a faible effet), et ma vision de la méthode PCR, tout s'explique très bien. La méthode PCR ne mesure pas la quantité de tel bout d'adn, mais la quantité de petites particules. Et si la quantité diminue aussi bien dans le cas de la prise d'une trithérapie que celle d'une prise d'anti-inflammatoire light ou de type cortisone, c'est parce que la concentration plus élevée des particules dans le sang fait que les petites particules s'agrègent beaucoup plus entre elles. Donc, il y en a peut-être autant d'émises à la base, mais il y en a moins au final, parce qu'elles s'agrègent entre elle. Elles sont donc remplacées par des agrégats de petites cellules qui sont forcément en nombre moins élevé (s'il faut 10 petites particules pour faire un agrégat, la formation d'un agrégat aura divisé la quantité de ces particules par 10). En supposant que la trithérapie agit bien comme je le dis, si la PCR mesurait bien la quantité d'ADN dans les particules, l'agrégation des particules ne devrait avoir aucune influence sur la charge virale. Si ça en a, c'est bien que ce n'est pas l'ADN qui est mesuré, mais bien la quantité de petites particules.

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