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Liebherr

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  1. L'utilisation du vecteur MLV comme contrôle dans ce papier n'est pas anodine. En effet, MLV ne peut infecter que les cellules qui prolifèrent*, or comme tu le vois, il n'y a pas ou quasiment pas de cellules GFP+ dans ce contrôle. En dehors du cas d'hépatectomie partielle que tu cites, les hépatocytes sont des cellules relativement non-mitotiques (et non, les auteurs du papier n'ont pas "hépatectomisé" ces pauvres rats ). http://www.ncbi.nlm....l=pubmed_DocSum Comment est-ce que ce fameux matériel génétique (il n'y a pas de GFP, à proprement parler, d'injecté) a été amené dans ces cellules puis a été intégré? C'est bien ça la question. * contrairement aux vecteurs basés sur le VIH qui, eux, peuvent infecter même les cellules quiescentes. C'est ça leur grand avantage.
  2. Les plasmides de packaging (qui contiennent donc notamment gag et pol mais pas env qui est remplacé par le env de VSV-G (si on laisse l'env d'origine, seuls les CD4+ (et autres) seront infectés) sont construits à partir des clones du VIH (adn proviral entier dans un plasmide) construits à partir des séquences des virions cultivés à partir de leucocytes isolés de patients. Donc oui, il provient des isolations originales (Il y en a eu d'autres depuis (particulièrement pour ce qui est du point de vue séquence génomique. cf ce site: http://hiv-web.lanl....b/mainpage.html)) Donc, sans rentrer dans la question endo-/exogène, est-ce qu'on est d'accord que, dans ces conditions (activation par PMA/PHA de lymphocytes), il y a effectivement production d'ARN avec une séquence fonctionnellement homologue à d'autres rétrovirus? Et que ces séquences sont effectivement fonctionnelles (on est d'accord que ces fameux lentivecteurs sont capables d'amener une séquence (par exemple GFP dans ce cas) à l'intérieur d'une cellule, de lui faire intégrer la séquence du GFP et de lui faire exprimer cette protéine)? Est-ce qu'on peut faire le pas d'après et dire qu'il y a effectivement production de virus quand ces lymphocytes sont activés par PMA/PHA et que ce qu'on obtient au microscope électronique peut, potentiellement, correspondre à ces virus? J'aimerais bien que tu me dises à quel moment il y a désaccord (si c'est le cas). PS en ce moment, je n'ai pas trop le temps pour répondre aux autres questions (notamment Psyence) mais j'espère bien y répondre prochainement.
  3. Ca n'a pas été trop dur à trouver parce que les lentivecteurs sont une des voies empruntées par les efforts en thérapie génique. Donc: Transduction par injection in vivo dans le foie de rats adultes de vecteurs dérivé du VIH exprimant la GFP sous un promoteur ubiquitaire (on est plus dans le cadre du promoteur neurone-spécifique du papier précédent). En rouge, marquage au iodure de propidium de l'ADN cellulaire. (vecteur VIH toutes les lettres sauf g qui représente une transduction avec un vecteur dérivé du MLV (mouse leukemia virus) qui est visiblement moins efficace dans ce modèle. a, 2 semaines, c, 4 semaines, e, 22 semaines après l'injection -> l'expression de la GFP est stable.). De nouveau, transduction par injection in vivo de lentivecteurs mais cette fois dans le tissu musculaire de rats adultes. a-d, 2, 4 et 8 semaines après injection du vecteur dérivé du VIH. e-f, avec MLV (de nouveau, moins efficace). http://www.ncbi.nlm....l=pubmed_docsum (désolé pour la qualité, j'ai du scanner l'article, je n'avais pas accès à l'édition électronique)
  4. Je dois dire que ce résultat ne me surprend pas, il sera d'autant moins surprenant s'il est issu d'un "end-point assay" (le produit de la PCR est marqué à la fin de la PCR puis quantifié) mais je pense que tu peux aussi obtenir ce genre de résultat avec la PCR quantitative (la fameuse real-time PCR, qui est la technique la plus récente et la plus spécifique). C'est un problème inhérent aux réactions faites à partir d'échantillons qui contiennent une quantité faible ou inexistante de matrice spécifique (on va supposer que c'est "gag" pour l'exemple). On va rentrer dans les détails de la qPCR par taqman (désolé si c'est rébarbatif pour certains mais je pense que c'est impératif si on veut comprendre ce qui se passe), pour comprendre pour quelle raison on peut avoir une charge virale >0 même en étant S- (en fait, je pense que même avec un extrait d'ADN de lombric, on peut avoir une CV >0 ): Tu as deux primers qui entourent le fragment (en 5' et en 3') que tu veux amplifier. Tu as un troisième "primer" (qui fait office de sonde) qui se lie au milieu de la séquence à amplifier (donc entre les deux primers) et qui est un oligonucléotide couplé d'un côté à un fluorophore (excitable dans les UV) et de l'autre à un autre flurophore (différent du 1er, qu'on appelle le "quencher") qui va absorber (et réemettre à une autre longueur d'onde) la radiation du 1er fluorophore si celui-ci est excité (principe du FRET) -> le capteur de la machine PCR ne détecte pas la fluorescence du 1er fluorophore tant qu'il est couplé au quencher. Ce 3ème "primer" permet d'augmenter encore plus la spécificité du système. Quand tu es à l'étape d'amplification de ton fragment, tes 3 primers sont liés à ta matrice et tu as l'extension 5'->3' (à partir des 2 primers sur les côtés, la sonde, elle, ne permet pas l'extension, sauf erreur) avec ta polymérase. Lorsque celle-ci rencontre ta sonde, elle va mettre en marche son activité exonucléase (5'->3') et digérer la sonde -> le fluorophore est libéré du "quencher" -> ainsi lorsque le fluorophore est excité par la machine, il va réemettre une lumière que le capteur de la machine PCR va pouvoir mesurer. La fluorescence va augmenter à chaque cycle en suivant une courbe sigmoïde. Donc tout va bien, a priori, tu devrais obtenir de la fluorescence uniquement à partir de l'amplification spécifique de ton fragment. Le problème, c'est que la polymérase peut se contenter de courts morceaux d'ADN double brin pour faire de l'extension nucléotidique (à condition que tu aies une hybridation parfaite du côté 3' de ton ADNdb sur un certain nombre de nucléotides, je ne connais pas le chiffre exact). Ce qui empêche que tu amplifies n'importe quoi, c'est la température d'hybridation. Si on prend un oligo au hasard, disons "ACGTGTACGT", celui-ci a une température d'hybridation prédite à 23°* -> même si les 10 derniers nucléotides en 3' de ton primer s'hybrident avec quelque chose de non-spécifique à gag, tu risques vraiment très très très peu de l'amplifier vu qu'à 60°C de température d'hybridation (et a fortiori à 72°C pour l'extension), il n'y a aucun couple primer-matrice de ce genre. Mais tu peux aussi avoir une matrice potentielle qui s'hybride sur une portion plus longue de ton amorce, disons 5'-CGAG*TTGT**ACGT*GAATAG-3' (les * représentent un "mismatch" avec la matrice qui ne sont pas rédhibitoires tant qu'ils ne sont pas du côté extrême 3'), là, la température d'hybridation de ce couple remonte à 51°C. Si tu es saturant en matrice spécifique à tes amorces (gag dans mon exemple), tu atteindras très rapidement (très peu de cycles) le seuil de détection que tu as déterminé (dans la phase log-linéaire de ta sigmoïde)-> les produits non-spécifiques constitueront une population extrêmement mineure dans ta population globale parce que n'ayant pas eu le temps de constituer une population assez importante pour générer une fluorescence conséquente. Si au contraire tu as peu ou pas de matrice, tu vas devoir faire beaucoup de cycles pour dépasser le seuil -> à chaque cycle, tu risques de produire du non-spécifique. A chaque nouveau brin non-spécifique, tu génères en fait une nouvelle amorce potentielle pour le cycle d'après -> plus tu augmentes le nombre de cycles, plus la probabilité augmente que tu obtiennes des fragments que la sonde et une amorce peut reconnaître et plus tu risques d'obtenir un signal pour un fragment qui n'est pas gag. En fait, la spécificité diminue avec le nombre de cycles (typiquement, on ne va pas au-delà de 40 cycles et plus raisonnablement pas au-delà de 35 cycles). De plus, une réaction PCR a un comportement stochastique qui est d'autant plus apparent quand la matrice spécifique n'est pas ou peu présente, ainsi entre deux tubes du même échantillon de la Ärztin en question, c'est tout à fait possible qu'un tube ait une CV>0 et que l'autre ait un CV=0. Si on veut être sûr que c'est gag qui à été réelement amplifié, il faudrait faire le protocole dont j'ai parlé un peu avant (migration sur gel, enz. de restr. et séquencage) qui n'est pas fait en screening je pense. La fluorescence (convertie en unité de charge virale) ne suffit pas pour cela. Ce que le département juridique d'une boîte pharmaceutique (à plus forte raison avec un marché aussi procédurier que les Etats-Unis) peut demander à ce qu'on mette dans une notice, ne me paraît franchement pas révélateur du bienfondé ou non d'une technique. Par contre, c'est tout à fait vrai que c'est une technique délicate à mettre en oeuvre et donc c'est vrai qu'on peut amplifier n'importe quoi si on ne fait pas attention. Je pense que c'est plutôt Roche qui veut se dédouaner de toute responsabilité par rapport un labo de diagnostic qui ferait effectivement mal son travail. *http://www.cnr.berkeley.edu/~zimmer/oligoTMcalc.html
  5. Les enzymes de restrictions sont utilisées pour construire le vecteur d'expression, c'est-à-dire pour placer les diverses cassettes(promoteur et gène notamment) dans le bon ordre dans le plasmide. Il n'est plus du tout question d'enz. de restr. au moment de l'injection (d'ailleurs, s'il y avait encore les enz. de restr. qu'on a utilisé pour construire le vecteur, il serait découpé avant même qu'on l'ait injecté ). L'intégration de la séquence dans le génome se fait à l'aide de l'intégrase (qui provient de pol) (il suffit d'oublier de mettre le plasmide de packaging (qui contient pol) au moment de la production de virus (il y a 3 plasmides en tout) pour s'en convaincre ) Plus de détails sur le système lentivecteurs, ici: http://biology.kenyon.edu/slonc/gene-web/L...l/Lentivi2.html
  6. Plus loin dans la lettre de réponse des auteurs: Donc dans cette étude, il y a 19 S+ qui n'ont pas pris de drogues entre le début de l'étude et décembre 1986 et de plus, ils n'ont pas été traité à l'AZT. Néanmoins, leur décompte de CD4 à chuté de 138 cellules par année en moyenne.
  7. Tu as bien raison de te prendre une pause, depuis que je suis ce forum, je suis vraiment impressioné par le nombre et l'exhaustivité de tes réponses. Au plaisir de débattre quand tu reviens.
  8. En fait, on peut faire une "charge virale" avec tout et n'importe quoi ! C'est tout à fait vrai. Si on fait une PCR n'importe comment, on peut amplifier une multitude de fragments nucléotidiques qui n'ont rien à voir avec le virus recherché. Ce qui est heureux, c'est que quand on fait une PCR n'importe comment, il est facile de déterminer qu'on a effectivement amplifier du matériel non-spécifique (cf. plus loin). Si par contre, on détermine les paramètres optimaux pour une PCR avec des amorces données (température d'hybridation des sondes, nombre de cycles, etc.), si on fait migrer sur un gel d'agarose le produit et qu'on obtient un seul fragment et que sa taille correspond ce à quoi on s'attend, si on arrive à digérer le fragment avec une ou des enzymes de restrictions spécifiques au fragment, si on fait séquencer le fragment obtenu et si en plus, comme c'est fait pour les mesures de charge virale, on rajoute une troisième amorce (principe du Taqman) pour la quantification alors on peut raisonnablement déclarer qu'on obtient une population enrichie à "très proche de 100%" de fragments spécifiques au virus.
  9. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.f...l=pubmed_docsum Embryon de caille transgénique obtenu à partir de la transduction d'un oeuf fécondé avec un lentivecteur dérivé du VIH qui fait exprimer la GFP sous le promoteur de la synapsine (-> ce qui fait que seuls les neurones expriment la GFP). Elles sont bien débrouillardes pour des protéines issues d'"ARN anormaux" C'est un simple abstract, on ne sait pas en détail comment ça a été obtenu. Peut-être bien qu'on a introduit dans l'oeuf la protéine produisant la fluorescence. Dans ce cas, sur un embryon, personnellement, ça ne m'étonne pas qu'on puisse obtenir ça. Et puis, si c'était le VIH qui était à l'origine de ce résultat, ça ne devrait alors pas être difficile de rendre fluo certaines parties d'un individu infecté avec un VIH modifié. Seulement, ça, jusqu'à nouvel ordre, on n'y arrive pas. Enfin, je parle du VIH, mais on pourrait prendre n'importe quel virus pour réaliser cette tache. Suis le lien, l'article est en libre accès A l'aide du virus, ils insérent la séquence codant pour la GFP dans le génome de l'embryon (l'insertion dans le génome est d'ailleurs détectée par Southern blot, figure 2), la protéine GFP n'est exprimée (et donc présente) qu'à partir du moment où cette séquence peut-être transcrite en ARNm et traduite en protéine GFP. S'ils avaient injecté la protéine même, tu n'en trouverais plus du tout chez l'adulte (je ne connais pas la demi-vie de la GFP mais ça doit se compter en heure, même pas en jour) et surtout tu n'aurais pas cette localisation spécifique de la fluorescence dans les neurones (ici, grâce au promoteur de transcription spécifique aux neurones). Cette spécificité répond à ta deuxième question, il me semble.
  10. Est-ce que tu aurais des exemples de tests avec lesquels on obtient du tout ou rien? Sacrément efficace comme trombone à coulisse : http://www.ncbi.nlm....l=pubmed_docsum Embryon de caille transgénique obtenu à partir de la transduction d'un oeuf fécondé avec un lentivecteur dérivé du VIH qui fait exprimer la GFP sous le promoteur de la synapsine (-> ce qui fait que seuls les neurones expriment la GFP). Elles sont bien débrouillardes pour des protéines issues d'"ARN anormaux"
  11. L'échantillon est lysé avant de procéder à l'elisa ou au wb, il n'y a aucune cellule vivante dans ce que tu rajoutes à ton puit (elisa)ou à ta membrane (wb). (Si j'ai bien compris ta question).
  12. Je pense que c'est le point le plus important qui ait été relevé dans ce topic. On est encore bien, bien, bien loin de pouvoir faire de la recherche "prédictive" dans le cadre des sciences de la vie.
  13. Attention, individuellement, aucun des 70 facteurs cités dans le lien ne mènent à une séropositivité établie.* En France, une personne est déclarée séropositive lorsque son (ses) elisa (répétés le cas échéant) + son western blot est positif pour 3 bandes spécifiques au virus (2 env + "1 pol ou 1 gag"). Le WB est répété le cas échéant. http://www.anaes.fr/anaes/Publications.nsf...pdf?OpenElement Lorsqu'un résultat "intermédiaire" est obtenu (p.ex. elisa+WB avec<3 bandes), un WB doit être répété plusieurs mois après pour voir l'évolution du profil des bandes. Or, chacun de ces facteurs entraîne une positivité soit pour l'elisa (p24) soit partiellement pour le WB (1 bande ou plus, je ne sais pas quel max a été constaté dans ces références). Un autre facteur qui doit être pris en compte, c'est que ces articles commencent à dater. Les tests réalisés il y a 15-20 ans ne sont pas nécessairement les mêmes qu'aujourd'hui: (dans l'article) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.f...l=pubmed_docsum Aujourd'hui, les protéines sont synthéthisées in vitro (protéines recombinantes) pour éviter ce problème de contamination de culture. Il serait donc bon de faire le tri des articles de cette page qui sont encore pertinents par rapport à la situation actuelle. *Je n'ai pas regardé chacun des 64 articles, corrigez-moi s'il y en a un qui parle de séropositivité établie à partir d'un seul facteur.
  14. Ce n'est pas que pour lui, c'est la recherche expérimentale qui tient sur ce principe. Les chercheurs n'essaient pas de faire "L'"expérience qui va prouver une théorie (cette expérience n'existe pas de toute manière, ça reviendrait à nier que chaque technique a ses limitations) mais à établir un faisceau de résultats expérimentaux qui vont étayer une hypothèse.
  15. Tu veux dire des symptômes comme une élevation du stress oxydatif suite à une infection virale? http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.f...0&dopt=Abstract
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