Corrigé par Nico111 :

La je t'arrête, en fait l'amorce ne peut s'hybrider qu'avec la séquence COMPLEMENTAIRE, et ceci est du au nombre diférent de liaison que les bases forment entre elles (2 pour C-G et 3 pour A-T)...
Question spécificité je pense par contre que tu t'égare vraiment en tout cas ta réponse est carrément infondée...

Si je me suis permis de répondre c parce ke j'ai fait pas mal de PCR (et raté pas mal d'ailleur...)
Mais c promis je retourne dans mon sommeil dogmatique...

Moi aussi je t'arrête. C'est exactement la question que j'ai abordée. Donc, tu réponds à ma question en faisant comme si tu apportais un élément nouveau qui répondrait à ma question, alors qu'il n'en est rien. Tu me dis qu'il y a comme un système clef/serrure spécifique, alors que la question que je pose, c'est s'il y a vraiment confirmation qu'il y a un système clef/serrure spécifique.

On a déjà fait un topic là dessus non ? En tout cas sur la méthode PCR je disais que ce n'est pas la méthode qui est en cause mais comment tu l'utilises (quelles amorces, leur longueur , température d'hybridation etc......)
Pour ce qui est de la reconnaissance de l'amorce avec la séquence à détectée (ADN ou ARN) ce n'est pas ce que j'appèle un système de reconnaissance clef/serrure mais plutôt collage. En effet si tu fait une PCR sur un extrait d'ADN avec disons des amorces qui font 5 bases tu sortiras tout est n'importe quoi car ce n'est pas assez long et donc spécifiques. Pour avoir le plus de chance d'amplifier uniquement ce que tu cherches il faut des amorces d'au moins disons 12 nucléotides (par example moi avec un extrait d'ARN de cellules infectées j'utilise des amorces qui hybrident avec 16 nucléotides sur la séquence que je recherche, avec le réglage de témpérature adéquate je n'obtiens qu'une bande qui correspond à ce que je cherche et rien en contrôle avec de l'ARN de cellules non infectées). Bref la PCR ou RT-PCR est spécifique avec les bonnes amorces et les bons réglages mais (comme toute expérience) ça nécessite les bon réglages et les bons contrôles. J'ai été surement pas clair du tout pour beaucoup c'est technique je sais mais si quelqu'un veut de précisions ne pas hésiter à demander.

Pas clef /serrure mais collage ou non, partiel ou total. Quand à un collage non spécifique oui, potentiellement n'importe quelle amorce peut se fixer sur quelque chose de non spécifique.

Fondamentalement oui ça peut arriver mais ça dépend de la séquence de l'amorce, si la séquence est conservée entre l'homme et l'animal etc.....tu peux même mais pour des gènes extrêmement conservés (c'est rare) amplifier une séquence de levure avec une amorce faite pour l'ADN humain. Mai sça c'est de la théorie, en pratique si l'appariement n'est pas parfait entre l'amorce et l'ADN ou ARN tu vas fair sauter cet appariement en augmentant la température d'hybridation lors de la PCR et là c'est souvent radical.
Ensuite si tu appliques cela à la détection d'un agent infectieux (car j'imagine que c'est ça ) ton contrôle négatif avec cellules non infectées est là pour te dire si c'est spécifique.

Oui, donc, ça pose problème quand même, non ? Si on peut amplifier une séquence de levure avec une amorce faite pour l'ADN humain, c'est un peu gênant tout de même (même s'il faut que le gène ait été bien conservé).

Le fait que la chaleur fasse sauter la liaison si celle-ci n'est pas parfaite, c'est la théorie. Faudrait là aussi voir s'il y a des documents le confirmant (je ne parle pas dans l'absolu, bien sur, mais dans les conditions de l'expérience, c'est à dire qu'on a des ADN cibles identifiés qui ne vont pas se détacher de l'amorce à la température T et des ADN non cibles qui se sont liés avec les amorces et qui vont s'en détacher à la dite température T). Il est tout à fait possible qu'un certain nombre de liaisons non voulues reste en place. Et quand on travaille avec si peu de matériel génétique, la moindre incertitude peut tout foutre en l'air.

Si on estime qu'il y a 100 cellules dans la soupe qu'on analyse et que les amorces puissent se lier à 100 ou 200 cellules par erreur, ben, au final, il se peut très bien qu'il n'y ait eu aucune cellule telle que celle qu'on recherchait et que tout ce qui a été amplifié l'ait été par erreur.

Oui, mais ça c'est en labo, lorsqu'on met au point la méthode PCR pour tel ADN ou ARN. Et on va se concentrer sur les cellules cibles (exemple, les cd4), pas sur une soupe de cellules (avec potentiellement d'autres cellulles que les cd4) et de débris divers. Pour savoir si c'est spécifique, il faudrait analyser des tonnes de cellules et débris différents. Je ne pense pas qu'on fasse ça.

Lol ouais possible dans de très rares cas et encore. C'est marrant parce que globalement ce que tu me dis là c'est la théorie et en pratique je te dirais que non, on ne détecte pas comme ça n'importe quoi , quelques réglages et on élimine le plus souvent les contaminants.

Théorie oui mais je peux t'assurer q'un seul malheureux degré peut faire qu'on obtient ce que l'on veut ou rien du tout.

Plus tu augmentes la temp. plus tu es spécifique car un mauvais appariement de ton amorce sur las séquence cible va sauter de plus en plus facilement et c'est drastique. La faible quantité de matériel n'est pas un problème (jusqu'à un certain point bien sur) car la PCR fait 2puissanceN copies par pcr avec n=nombre de cycles et la moyenne c'est 30 alors fait un peu le calcul même en partant de 10 copies de ce que tu recherches. Encore une fois le problème c'est les amorces et leur spécificité, la méthode PCR n'est pas en cause.

???? pareil, amorces sont elles spécifiques de ce que tu cherches et as tu fais les bons réglages, en plus le contrôle négatif est là pour savoir si tu es spécifique ou pas. Quant au fait que ce soit une soupe de cellules avec pleins de trucs aucuns problèmes le plus souvent, avec les bonnes amorce c'est ultra spécifique. Nous, on fait des RT pcr de cellules infectées et même de broyat d'organes infectées et dans la bouillie d'ARN extraits on obtient spécifiquement ce qu el'on cherche du matériel génétique du virus, sans bande contaminante.

Et alors les techniques de diagnostic sont élaborées en labo d'abord sur des lignées cellulaires infectées puis on passe aux organes d'animaux infectés puis on finit avec des échantillons de fluides ou de tissus de personnes infectées (par exemple) pour vérifier le test , sa spécificité etc......Ici on va dire que HIV infecte principalement les T4 donc on prend le sang d'un patient, on isole les cellules et on extrait l'ARN (ça c'est de la soupe non?) et on pratique la PCR. Tu veux aller voir d'autres cellules ? soit mais quel est l'intérêt si le virus ne les infecte pas ? tu vas me dire et si on détecte un signal non spé dans ces cellules ? eh bien c'est que les amorces ne sont pas si spé que ça mais en quoi ça remet en question le test sur le T4 SI avec des T4 non infectés on n'obtient rien en PCR ????? Bien sur il faut savoir sur quoi on travaille, si le VIH n'existe pas ou ne provoque pas cette pathologie alors ton test ne veut rien dire, il reflète effectivement autre chose (stress oxydatif, apoptose, etc.....) mais la technique de PCR est hors de cause, ce n'est qu'un outil très puissant, à toi de te débrouiller pour avoi rquelque chose de spécifique et de propre, de savoir sur quoi tu travaille et si l'hypothèse de travail est fausse forcément ça fout le test en l'air, pas la technique..

Ben, je sais pas, c'est toi qui me dis qu'on peut "amplifier une séquence de levure avec une amorce faite pour l'ADN humain". Et là, il ne s'agit pas de contaminant, mais simplement du fait que la méthode PCR n'est pas spécifique (ou pas assez).

Ben justement. Si l'écart de température entre l'obtention de ce que l'on veut et le rien du tout est si faible, la fourchette dans laquelle se joue le fait que le lien imparfait saute ou pas est extrêmement réduite. Donc, on ne doit pas tellement pouvoir jouer sur la température pour éliminer les mauvaises liaisons tout en gardant celles avec les ADN cibles.

Mais, quand même, on ne fait pas l'expérience avec tous les ADN ou ARN qui pourraient se lier avec l'ADN ou ARN amorce. Donc, ce que tu me dis, c'est de la théorie. Avec certains ADN, c'est possible, mais avec d'autres, peut-être pas. Et comme on ne test pas tous les ADN ou ARN...

Non, quand j'ai dis "Et quand on travaille avec si peu de matériel génétique, la moindre incertitude peut tout foutre en l'air", c'était relié à ce qui venait après. Ce que je dis, c'est, supposons que tu as des ADN cibles et des ADN non cibles et que l'amorce se lie aussi bien avec l'un qu'avec l'autre. Le problème c'est que tu as très peu de chacun d'entre eux. Alors, il se peut très bien qu'il n'y ait que l'ADN non cible en fait. Et que malgré la température, l'ADN non cible reste lié avec l'amorce. Et là, tu obtiens un résultat alors qu'il n'y a pas d'ADN cible au départ. Le fait qu'il y ait très peu de matériel fait que ça peut se jouer à peu de choses. Il peut y avoir 10 ADN non cibles, et aucun ADN cible, mais la présence de l'ADN non cible, même en très faible quantité, fait réagir le test alors qu'il n'y a rien de ce qu'on cherche. Du coup, ça entraine une forte incertitude sur la validité des résultats.

Le problème, c'est que, pour savoir si les amorces sont spécifiques de ce que tu recherches, il faut tester je ne sais pas combien de millier ou de centaines de milliers d'ADN ou ARN différents. Tu ne peux pas dire que ton amorce est spécifique tant que tu n'as pas montré qu'elle ne réagit pas avec d'autres ADN ou ARN.

Le controle, il se fait avec très peu de cellules différentes je suppose (parce que la culture de cellule n'en contient pas énorméments de différentes a priori. Et c'est encore pire si c'est basé sur des échantillons filtrés pour n'avoir que des particules de taille virale) Donc, impossible de savoir si, dans des conditions où il y aurait beaucoup de cellules différentes (un test de charge virale par exemple), il n'y aurait pas d'autres ADN ou ARN faisant réagir le test.

Tu parles de broyats d'organes infectés, seulement, est-ce qu'à ce moment là, on fait des tests de controle avec un autre broyat ? Et même avec beaucoup d'autres broyats ? Parce que, si ça se joue avec très peu de cellules, un échantillon peut aussi ne pas en contenir.

Sinon, qu'est-ce que tu entends par bande contaminante ?

Ce qui pose encore le problème des échantillons de controle et de leur nombre. On peut tomber sur une échantillon de controle qui ne va pas réagir. Il faudrait donc plusieurs centaines d'échantillons de controle pour être sur qu'on a bien un truc spécifique.

Et se pose apparemment le problème des différentes étapes de vérification (étape 1 : culture de cellule, étape 2 : broyat d'animaux, étape 3 : sang d'animaux ou de personnes lambdas), du nombre de cellules différentes impliquée et aussi du nombre d'échantillons de controle à chaque niveau. Au niveau de la lignée cellulaire, il va probablement y avoir peu de cellules différentes (susceptibles de réagir avec les amorces alors que ce ne sont pas des ADN cibles), ce qui rend moins valable la procédure de controle. On peut penser aussi que le nombre d'échantillons non infectés reste assez faible. Rendant là aussi moins valable la procédure de controle.

Cela dit, le problème de cette défense, c'est que quelque soit la cause qui fait réagir la PCR faussement (une particule de stress présente chez beaucoup de monde, ou le fait que la methode PCR réagit avec un peu n'importe quoi), le fait que la PCR réagit faussement positive chez des individus qui n'ont pas le virus, normalement, ça devrait se répercuter sur le stade 1 (l'étape de la culture de cellules), et on devrait avoir des cultures de controle qui devraient réagir positives à la PCR. Parce qu'elles devraient posséder aussi ces particules de stress. Donc, si la PCR ne réagit pas sur les cultures de controle, c'est qu'il y a un problème, soit dans la méthode PCR, soit dans la culture de controle, soit dans la façon de faire des expérimentateurs. Ou alors, ils ne pratiquent pas la méthode PCR sur l'échantillon de controle.

Selon ce que tu dis, il ne peut pas y avoir de faux positifs avec la méthode PCR, quelque soit l'étape (culture de cellules, broyat d'animaux de laboratoire, échantillons sanguins d'animal ou d'humain lambas). Selon toi, la méthode PCR est ultra spécifique. Donc, comme il est clair qu'il y a des faux positifs dans le cas des séropositifs au VIH (des gens qui n'ont jamais été en contact avec le virus ont une charge virale), soit c'est parce que la chose qu'on détecte n'est pas virale (une particule de stress par exemple, ou autre chose), soit parce que la méthode PCR déconne. Selon toi, dans ce cas, c'est forcément parce que la méthode PCR ne détecte par un virus mais une particule autre. Donc, pour toi, la méthode PCR reste valable. Seulement, le problème, c'est que ça devrait se répercuter aux étape antérieures. Il y a des particules de stress dans les broyats et dans les cultures de cellules, puisqu'on détecte quelque chose avec le test PCR (la même chose que ce qu'on détecte chez des individus lambdas). Donc, il n'y a pas de problème d'absence de ces particules à ces étapes là. Et du coup, on ne voit pas pourquoi il n'y aurait pas de particules de stress dans les broyats et dans les cultures de cellules de controle (puisque ce sont des particules endogènes, des conditions similaires de culture devraient produire les mêms particules). Et donc, on ne voit pas pourquoi la PCR ne réagirait pas aussi dans les échantillons de controle. Si ça ne le fait pas, c'est donc bien qu'il y a un problème avec la méthode PCR, ou alors dans le protocole d'expérimentation ou alors, parce qu'on n'applique pas la méthode PCR aux échantillons de controle, ou alors, qu'il n'y a tout simplement pas d'échantillon de controle.

Donc, il y a un problème sur l'expérience faite avec les cultures de cellules (et les broyats). Et comme, selon toi, la méthodologie est standardisée et donc reprise par tous les virologues, et que les expérimentateurs sont des gens sérieux, si ça déconne pour le VIH, ça peut déconner potentiellement partout, sur toutes les expériences faites avec des virus.

Bref, s'il y a des faux positifs à une des étapes, qui impliquent que les particules sont endogènes, il doit y en avoir à toutes les étapes. Ou alors, c'est qu'il y a un problème dans le protocole expérimental.

Ce message a été modifié par aixur le Mardi 28 Février 2006 19h51

Dans de TRES rares cas de protéines très conservées. Ce n'est pas que ta méthode PCR en soi n'est pas spécifique, c'est que tu as utilisé des amorces qui amplifient une protéine conservée entre la levure et l'homme (et encore il faut tomber dessus car la séquence n'est pas 100% identique).

Les cas de figures sont multiples. Moi par exemple,en général, si j'amplifie des morceaux de virus à 40 degrés pour l'hybridation j'ai du non spécifique. A 45 moins de bandes spé , à 50 plus de non spé , à 55 en général j'obtiens toujours la bande d'ADN que j'attend sans bande contaminante non spé. Donc un petit écart de temp peut beaucoup jouer mais si tu continues à augmenter la temp ta réaction marche toujours et tu n'as plus de non spé donc c'est bon.

On travaille sur environ 5 à 10 lignées de céllules différentes plus sur moustiques et rats/souris. Quand on extrait l'ARN global de cellules ou de tissus infectés on a beacoup mais beaucoup plus d'ARN des cellules que d'ARN viruax (au moins 1000 fois plus) mais ça n'em^peche pas d'obtenir uniquement ce qu'on cherche avec les amorces spé et la bonne temp. Contrôle nég non infecté ne donne rien bien sur. Ca te suffit ?

Alors t'es mal barré ! faut changer l'amorce.

Oui mais là tu supposes que les amorces ne sont pas spé donc c'est de toute façon mort. d'où la présence des contrôles négatifs non infectés, non malades. Si ça sort aussi avec ta PCR alors amorces à la poubelle et si tu suppose que l'amorce au lieu d'être spécifique du pathogène ne fait que cibler des ARN cellulaires en fait alors bien sur ta manip ne veut rien dire, tu ressortiras tout le temps une réaction positive.

Voir ci-dessus on a plein de cellules différentes et un extrait d'ARN cellulaire contient des milliers, milions ? d'ARN différents.

Il ya beaucoup de cellules différentes lors du test de charge viral ? Bof pas tant que ça. Ce test se fait par PCR quantitative je crois mais je ne sais pas le protocole précis. De toute façon idem il suffit de faire le contrôle avec des échantillons que l'on suppose non infecté. Si c'est aussi positif alors test à la poubelle.

Lol à ton avis ????????? en général on travaille par lot de 3 souris, non infectées , infectées etc..... Sur cerveau, rate , foie rein, poumon et autre encore. Et ça a été fait et refait.

En PCR basique, je veux par exemple détecter si mon virus est là, je prend deux amorces qui hybrident dans son ARN . Si ça marche je dois obtenir une bande d'ADN après RT PCR d'une taille X par rapport à ce que j esais de son génome . Quand je fais migrer la RT PCR sur un gel d'agarose pour séparer en fonction de la taille les morceaux d4ADN éventuellement amplifiés je dois obtenir une bande à la taille X. Si j'ai autre chose à d'autre taille ça doit être soit une amplification non spé ou alors que je n'ai amplifié qu'une partie de l'ARN que je recheche. A voir avec le contrôle nég.

Ton échantillon de contrôle te donne du positif ? alors manip à la poubelle et tu refais. Quant à établir un diagnostic eh bien oui il faut tester avec pleins d'échantillons (au - 500-1000 en général)

Non on peux avoir du faux positif, on peut ne jamais se débarasser de bandes cobtaminantes malgré des amorces spé. A toi alors de changer d'amorce ou de conditions de PCR.

OUi parce que tes amorces ne sont pas complètement spé par exemple. Si ta PCR peut être positive si un autre pathogène infecte les cellules ç'est un autre problème. Si tes cellules sont absolument saine et que c'est positif alors test à la poubelle.

non si tu trouves pareil avec les animaux infectés, et en plus tu ne fais pas qu'une PCR tu fais plein d'autres test sur les protiénes virales , si un effet destructeur des cellules, etc...ça ne repose pas que sur un pauvre test PCR , on ne fais un diagnostic que quand le virus est bien caractérisé. S'il ne l'est pas bien sur.......

ce sont tes amorces qui ciblent autre chose. Il faut en changer , vu la taille du génome viral c'est possible. Si tu n'y arrives pas, et que c'est toujours positif alors il faut se poser des questions sur la validité de ton virus.

Je suis désolé si je radotte, j'ai l'impression de répéter la même chose. J'ai du mal à te répondre ou me faire comprendre il me semble car là ton raisonnement fait comme si tous les contrôles étaient positifs. Certaines personnes répondent positifs à ce test alors qu'ils ne sont pas infectés mais pour autant c'est une très faible partie parmi les personnes testées et les raisons peuvent être multiples. Si lors de la mise au point de ton test les echantilons non infectés sont négatifs, si tu as des faux positifs ensuite alors c'est que le patient a surement un problème (stress particulier, infection autre , médoc etc...) mais il ne faut pas s'arrêter qu'à un seul test , on doit regarder les symptomes + différents tests.

Perso j e n'en ai pas.

La PCR est une méthode mais il faut adapter les amorces les conditions etc.....

Faut espérer mais comme d'hab le 100% n'existe pas!

Pas sur un travail expériemental en général .Qu'il y ait un très faible % de faux positifs dans des échantillons de diagnoqtic ? oui la bio ce n'est pas un science exacte, il faut identifier les sources de faux positifs. Si ta spécificité de diagnostic est par exemple de plus de 95 % = moins de 5% de faux + dans les test (c'est environ le mini accepté je crois) c'est bon non ?

Je m'arrête , il est tard , j'ai peur de ne pas avoir su me faire bien comprendre mais bon ne pas hésiter à me faire préciser.