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La méthode PCR

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Sur sidasante, il y a quelques documents expliquant que la méthode n'est pas fiable parce que donnant des résultats très variables et trouvant une charge virale chez des personnes séronégatives (ce qui est déjà pas mal pour invalider la méthode). Ils expliquent aussi que puisqu'on n'a pas trouvé le virus, on ne peut pas se servir de cette méthode pour le mesurer. Mais, il n'y a pas de documents expliquant bien comment fonctionne la méthode PCR.

Donc, puisqu'on parlait de la méthode PCR l'autre jour, j'ouvre ce topic pour qu'on analyse la chose et qu'on puisse comprendre un peu mieux comment ça fonctionne et surtout, pourquoi ça n'est pas valable pour mesurer la charge virale.

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Bon, on a déjà ça de Cheminot

Tout d'abord, Psyence, il ne s'agit pas de répliquer des anticorps, mais de répliquer un morceau d'oligo (une suite de nucléotides, donc un morceau d'ADN, ici d'ADN appelé proviral) avec une protéine découverte par Kary Mullis, qui s'appelle simplement une polymérase et qui provient (si je me souviens bien) d'organismes aquatiques (Thermus Aquaticus trouvé dans le lac de Yellowstone). Cette réplication ne peut se faire que si on rajoute un "primer", qui est une copie d'une petite partie (terminale) de l'ADN que l'on veut multiplier. Il faut aussi des nucléotides triphosphatés (thymidine, guanidine, cytidine et adénosine).

En fait, on a trouvé chez les personnes malades d'immunodéficience une quantité importante de ces oligo, que l'on a présumé provenir d'un virus - mais ils peuvent tout aussi bien provenir de l'ADN humain, dont on sait que seul 1% possède une fonction reconnue actuellement. Voir le post de Bipol

Il est tout de même certain que les personnes malades ont ces oligos en abondance (d'ailleurs on n'a pas trouvé d'ADN "proviral" intact dans les cellules, uniquement des oligos qu'on a rassemblé selon les règles déduites des connaissances actuelles sur l'ADN (codons, codons stop,...)

Kary Mullis, d'une part, remet en cause le fait que l'on puisse quantifier ces oligos, la PCR, qu'il a inventée, étant trop aléatoire.

Par ailleurs, un médecin allemand sceptique du vih, Frau Sacher, a envoyé au labo son propre sang à la place de celui d'un de ses patients malade, et le test PCR (qui n'est fait que sur les gens déjà diagnostiqués, et dont on ne remet pas en cause le diagnostic pour cause de théorie à respecter (LOL)) est revenu avec un nombre de copies de 5000, alrs que ce médecin, bien sûr n'est ni séropositif, ni ne fait partie d'un groupe à risque.

Corrigé par Nico111 :

Si je peux apporter quelques précisions/correction (désolé Cheminot !). La PCR utilisée pour la charge virale va détecter les ARN du vih et non pas l'ADN du vih intégré dans les cellules (=ADN proviral présent en très faible nombre). Pour détecter ces ARN viraux normalement correspondant à l'activité de multiplication du virus il faut bien sur les amplifier car sinon c'est très difficilement détectable. Don cpour cela on va utiliser la PCR (dans ce cas il faut d'abord transformer ces ARN en ADN par rétrotranscription car la PCR n'amplifie qu'à partir d'ADN). Ensuite cette masse amplifiée est révélée par différentes techniques.

La PCR telle que faite en routine dans les labos n'est pas faite pour être quantitative, elle mettra en évidence si on a pas , un peu ou beaucoup des molécules que l'on recherche. On aura un ordre d'idée mais grossier. Il se développe maintenant de la PCR dite quantitative ou "temps réel" qui elle est sensée être quantitative. En fait pour savoir si la technique est au point on vérifie la proportionalité du signal on btenu avec la quantité d'ARN mis dans l’échantillon. En général ça marche plutot bien sur les virus qui se répliquent fortement. Sur le HIV, je n'ai pas lu beaucoup de truc don cje ne peux pas dire. Une chose qui est sure c'est que l'amplification n'est pas aléatoire, elle dépend de la quantité de matériel présent dans l’échantillon et des oligonucléotides utilisés pour reconnaitre ce matériel et l'amplifier. Les problèmes peuvent donc venir de ça, qu'est ce qu'on déctecte ? est-ce spécifique ? Normalement il y a les contrôles négatifs lors des phases de mise au point ........

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Je la décrirais bien mais .....c'est long à faire ! Va voir le site http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/principe.htm et si il te reste encore des questions demande. En tout cas comme je l'ai précisé avant ce n'est pas le technique qui est l eproblème c'est ce qui est utilisé pour amplifier la séquence d'ARN ou d'ADN recherchée. On utilise pour copier cette sequence à rechercher une sonde ADN ou ARN qui va se coller à la séquence cible si elle est présente et va permettre sa copie en milions d'examplaires . Le problème vient donc surtout des sondes (appelées amorces) : qu'est ce qu'elles ciblent ? est-ce spécifique de ce qui est recherché ?

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g trouvé cela ? est ce que cela veut dire que plus on prends de magnesium, plus la charge virale de betise grossie ?

http://info.med.yale...d/tavi/p14.html

http://www.bio.david.../magnesium.html

http://www.bio.net/h...ary/040003.html

*qu'est ce qu'elles ciblent ? est-ce spécifique de ce qui est recherché ? ..*

moi je pense, en resumé des trucs que j ai pu lire sur le net et cela est que ma prope idée, tout ce qui est infectieux.....du genre une ghono, un staph ou du candida font reagir la pcr.........dans le cadre du vih en fait les reactifs utilisés seraient un gros melange des bebetes citées ci dessus.......mais avec *l experience* la science progresse et affine ses recherches.........on peut imaginer dans 10 ans une recherche de mst classique ( chlamidaye) directe par pcr !

....( cela se fait deja d ailleurs) du moins, aparement il me semble que c est le but recherché.

http://www.quotimed....FArt171622.html

http://www.atoute.or...mID5/12099.html

http://www.gyneweb.f.../13audebert.htm

http://216.109.124.9...&icp=1&.intl=fr

et meme mieux, le cancer serait ?! detectable par pcr :

http://www.gyneweb.f...e/detec-hpv.htm

bref suffit de taper mst pcr sur yahoo!......

BEURK ! mais cette hypothese semble la bonne non ??

avoir une pcr, seropo ou pas pour le vih, indique qu il y a quelque chose qui tourne pas rond, cellulairement parlant, du moins d apres leurs criteres ! .

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Bonjour,

Je vais tenter de résumer un peu sur ce qui a été dit au sujet de la P.C.R lautre jour entre Nico111, Cheminot par rapport à la question que jai posée, à savoir :

Est-il possible que ce qui soit détecter en réalité cest un nombre produit par la PCR ?

Pour ma part, en ce qu concerne la P.C.R ce que je souhaitais amener comme distinction en ce qui concerne le concept de charge virale était la suivante :

« quelque chose qui se réplique » et « quelque chose que lon réplique »

Pour savoir si le sens des résultats de la P.C.R en ce qui concerne la mesure de la charge virale est vraiment pertinent.

(selon nico111 et cheminot)

Si le procéder semble faire des copies de façon non-aléatoire, cest-à-dire quà chaque fois que celui-ci est accompli il produit un nombre de copies approximativement identique dune fois à lautre, alors il est correct de parler « d amplification », en toute analogie avec une loupe qui grossirait de la même façon nimporte quel objet. Autrement dit, la P.C.R namplifierait pas une fois 6 x et une autre seulement 3 x.

De ce côté, la P.C.R semble donc ne pas poser de problème. Encore faut-il être certain du nombre initial d « oligos » que lon souhaite amplifier grâce à la P.C.R pour justement mieux les détecters. Ce qui est un peu paradoxal dans le sens ou le but de cette amplification est justement la mise en évidence dune masse autrement « très difficilement détectable. »

Maintenant « ce qui est » répliquer avec la P.C.R demeure très important sur le sens du résultat de la charge virale. Si la P.C.R réplique autre chose quexclusivement de lARN virale du vih ( qui est dabord rétro-transcript en ADN), cest-à-dire quelle réplique dautre séquence que ce qui est recherché, du fait que lamorce nest pas suffisamment sélective, les résultats seront imprécis et non-spécifique. Tout et nimporte quoi sera « répliqué » par la P.C.R et considéré comme étant le reflet de lactivité de démultiplication du VIH.

Ceci résume correctement le problème poser par la P.C.R ?

Amicalement.

Modifié par Psyence

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non, pas tout-à-fait, Psyence.

Le problème est de savoir qu'est ce que l'ARN qu'on attribue au "vih".

C'est le problème de la rétrovirologie en fait, pas celui de la technique PCR.

D'ailleurs c'est pour cela que Duesberg est en porte à faux par rapport à Papadopoulos et Lanka, qui eux sont clairs : cet ARN ne provient pas d'un virus infectieux, mais est signe de la dégradation progressive de la santé des gens, dégradation que nous vivons tous à un degré plus ou moins important.

Et c'est pour cela que Roberto Giraldo dit :

"nous sommes tous séropositifs"

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Un autre truc : de Wilhelm sur Aids Myth Exposed.

Quand l'orthodoxie se vante de l'efficacité de ses drogues anti-retroviral, elle parle d'une baisse de la "charge virale" comme résultat de la prise de médicaments.

Maintenant cette "charge virale" n'est pas le nombre de particules de virus dans le sang.  C'est une valeur théorique dérivée de la technique PCR inventée par Kary Mullis. Ils appliquent un échantillon de sang venant du patient à une culture de laboratoire de cellules cancéreuses.  Ils ajoutent des produits chimiques pour "activer" les cellules (autrement rien n'est produit), et après quelques temps ils récoltent et dosent l'acide nucléique qu'ils considèrent appartenir au VIH.  À partir de cette quantité, ils calculent combien de "VIH" il devait y avoir dans l'échantillon de sang de départ.  Ainsi, ils arrivent au nombre de particules de virus par unité de volume qu'ils croient que le patient a. Pour quiconque croyant ça, j'ai de bonnes nouvelles:  Il y a ce pont de Brooklyn que j'ai à vendre, et je peux vous le laisser.  Vraiment pas cher...  En fait, la méthode PCR amplifiera n'importe quel morceau de matériel génétique dans l'échantillon.

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L'empirisme est de rigueur ...

Comme pour les autres tests (Elisa et WB) ...

Ce qui est scandaleux dans tout cela est cette "précipitation", voire cette "gourmandise", a plongé les intéressés dans des protocoles anti-viraux qui ont des effets catastrophiques à court, moyen et long terme, indépendamment du fait de plonger également ces intéressés dans un état mental affreux et conforté par les effets secondaires de ces saloperies.

Au gré des colloques exotiques, la "pensée" évolue ... tantôt on prône "l'attentisme" (ce qui est toujours mieux que la seconde formule), tantôt on va vers le "taper vite et taper fort" (c'est terrible ça) ...

Les séropos sont des marionnettes qui se font tirer les fils par des guignols ... les séronégas (le grand public) sont pris pour des gogos par les mêmes.

Qui s'y retrouvent dans ces démarches ? ... toujours les mêmes ...

Aucune étude sérieuse, à ma connaissance, n'a été faite (si tant est qu'il y ait des études sérieuses sur la globalité de la question) sur les séronégas qui ont abandonné lesdites saloperies ...

Pas possible à faire ? (puisqu'aux abonnés absents) ... baliverne ! Il suffit de prendre le fichier de la SS (sur lequel, sans tarder, on inscrit le nouveau positif) et de voir :

1. qui a arrêté (plus de demande de prise en charge) et depuis quand (facile non ?) ;

2. quelles sont les pathologies colatérales de cette cohorte (par le biais des prises en charge).

Mais quand on ne veut pas trouver, on ne cherche pas ...

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En fait, on peut se demander si la méthode de liaison entre les amorces et les bouts d'ADN lors de l'utilisation de la méthode PCR, ne fonctionne pas plutot par collage au lieu d'une sorte de système clef/serrure (ou emboitement, ou un truc de ce genre). Donc, il se pourrait que ça se colle à n'importe quel type d'ADN et que ça n'ait qu'une très faible spécificité.

Si c'était le cas, il serait possible qu'on puisse trouver n'importe quel fragment d'ADN chez virtuellement tout le monde (dans la mesure où on n'analyse pas chacun des milliards d'ADN obtenus au final. On multiplie une soupe et on calcule la quantité de soupe à la fin. On n'analyse pas chaque morceau de la soupe obtenue. Donc, la soupe peut contenir n'importe quoi, les biologistes s'en foutent. Ils font confiance au fait que la soupe en question est pure et qu'il n'y a dedans que l'ADN qu'ils cherchent et ils se concentrent uniquement sur la quantité trouvée à la fin). Bref, si on veut trouver de l'ADN de chèvre chez un être humain, avec la méthode PCR, ça doit être possible.

Donc, la méthode PCR ne pourrait marcher que sur des échantillons complètement purs, pas du tout sur des soupes de cellules. Bref, ça n'aurait aucune valeur dans le cas de la mesure de charge virale.

Modifié par aixur

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Invité dongiovanni
(aixur @ Mardi 31 Janvier 2006, 16:02)

En fait, on peut se demander si la méthode de liaison entre les amorces et les bouts d'ADN lors de l'utilisation de la méthode PCR, ne fonctionne pas plutot par collage au lieu d'une sorte de système clef/serrure (ou emboitement, ou un truc de ce genre). Donc, il se pourrait que ça se colle à n'importe quel type d'ADN et que ça n'ait qu'une très faible spécificité.

Si c'était le cas, il serait possible qu'on puisse trouver n'importe quel fragment d'ADN chez virtuellement tout le monde (dans la mesure où on n'analyse pas chacun des milliards d'ADN obtenus au final. On multiplie une soupe et on calcule la quantité de soupe à la fin. On n'analyse pas chaque morceau de la soupe obtenue. Donc, la soupe peut contenir n'importe quoi, les biologistes s'en foutent. Ils font confiance au fait que la soupe en question est pure et qu'il n'y a dedans que l'ADN qu'ils cherchent et ils se concentrent uniquement sur la quantité trouvée à la fin). Bref, si on veut trouver de l'ADN de chèvre chez un être humain, avec la méthode PCR, ça doit être possible.

Donc, la méthode PCR ne pourrait marcher que sur des échantillons complètement purs, pas du tout sur des soupes de cellules. Bref, ça n'aurait aucune valeur dans le cas de la mesure de charge virale.

La je t'arrête, en fait l'amorce ne peut s'hybrider qu'avec la séquence COMPLEMENTAIRE, et ceci est du au nombre différent de liaison que les bases forment entre elles (2 pour C-G et 3 pour A-T)...

Question spécificité je pense par contre que tu t'égare vraiment en tout cas ta réponse est carrément infondée...

Si je me suis permis de répondre c parce ke j'ai fait pas mal de PCR (et raté pas mal d'ailleur...)

Mais c promis je retourne dans mon sommeil dogmatique...

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(dongiovanni @ Vendredi 03 Février 2006, 18:53)

La je t'arrête, en fait l'amorce ne peut s'hybrider qu'avec la séquence COMPLEMENTAIRE, et ceci est du au nombre diférent de liaison que les bases forment entre elles (2 pour C-G et 3 pour A-T)...

Question spécificité je pense par contre que tu t'égare vraiment en tout cas ta réponse est carrément infondée...

Si je me suis permis de répondre c parce ke j'ai fait pas mal de PCR (et raté pas mal d'ailleur...)

Mais c promis je retourne dans mon sommeil dogmatique...

Moi aussi je t'arrête. C'est exactement la question que j'ai abordée. Donc, tu réponds à ma question en faisant comme si tu apportais un élément nouveau qui répondrait à ma question, alors qu'il n'en est rien. Tu me dis qu'il y a comme un système clef/serrure spécifique, alors que la question que je pose, c'est s'il y a vraiment confirmation qu'il y a un système clef/serrure spécifique.

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alors que la question que je pose, c'est s'il y a vraiment confirmation qu'il y a un système clef/serrure spécifique.

On a déjà fait un topic là dessus non ? En tout cas sur la méthode PCR je disais que ce n'est pas la méthode qui est en cause mais comment tu l'utilises (quelles amorces, leur longueur , température d'hybridation etc......)

Pour ce qui est de la reconnaissance de l'amorce avec la séquence à détectée (ADN ou ARN) ce n'est pas ce que j'appèle un système de reconnaissance clef/serrure mais plutôt collage. En effet si tu fait une PCR sur un extrait d'ADN avec disons des amorces qui font 5 bases tu sortiras tout est n'importe quoi car ce n'est pas assez long et donc spécifiques. Pour avoir le plus de chance d'amplifier uniquement ce que tu cherches il faut des amorces d'au moins disons 12 nucléotides (par example moi avec un extrait d'ARN de cellules infectées j'utilise des amorces qui hybrident avec 16 nucléotides sur la séquence que je recherche, avec le réglage de témpérature adéquate je n'obtiens qu'une bande qui correspond à ce que je cherche et rien en contrôle avec de l'ARN de cellules non infectées). Bref la PCR ou RT-PCR est spécifique avec les bonnes amorces et les bons réglages mais (comme toute expérience) ça nécessite les bon réglages et les bons contrôles. J'ai été surement pas clair du tout pour beaucoup c'est technique je sais mais si quelqu'un veut de précisions ne pas hésiter à demander.

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Et puis très simplement, Aixur, s'il n'y avait pas cette attirance physicochimique par liaisons hydrogène entre cytidine-guanosine et adénosine-thymidine, eh bien, il n'y aurait tout simplement pas réplication cellulaire. C'est une donnée fondamentale de la duplication de l'ADN cellulaire. La polymérase qu'a découverte Kary Mullis fonctionne toujours ainsi. Ce qui est important pour la fiabilité du test, ce sont les amorces (primer).

Il est clair que quand il s'agit de rechercher la culpabilité d'un prévenu, l'amorce est toute trouvée et irréfutable : c'est l'ADN du prévenu (ou un morceau caractéristique), qui va permettre de polymériser (d'amplifier) l'ADN trouvé sur la victime uniquement si il y a concordance.

Dans le cas du "vih", l'amorce provient du clonage d'un ARN (ou d'un ADN), que l'on trouve bien chez la plupart des malades immunodéficients. Le problème est : ce qu'on trouve provient-il bien d'un rétrovirus pathogène?

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La question que je pose à travers la question "est-ce qu'il y a vraiment confirmation qu'il y a un système clef/serrure spécifique", c'est "est-ce qu'il y a des expériences prouvant que telle amorce ne va pas se lier avec un ARN ou un ADN qui n'est pas celui qu'on cherche, et ce, même si l'amorce est longue".

Exemple, on a un ADN d'humain identifié. On prend l'amorce. Est-ce qu'il y a des expériences montrant qu'en prenant de l'ADN d'une vache par exemple, on n'arrivera pas à le multiplier via méthode PCR en utilisant l'amorce de l'ADN humain. Expérience à faire avec l'ADN de nombreux animaux différents bien sur, pas seulement avec un seul animal. Expérience à faire aussi avec une soupe de cellule. Ca pourrait accroitre les chance de chopper un truc qui va se lier avec l'amorce.

L'exemple du test d'ADN dans les enquêtes judiciaire ne me convient pas parce qu'il ne répond pas à la question. L'amorce pourrait être non spécifique, mais tout de même, ne pas marcher dans un certain nombre de cas. Genre, ça ne va se mutliplier que dans un cas sur 50 (au lieu d'un cas sur 100 milliards).

De même, la longueur de l'amorce pourrait réduire le problème, sans le supprimer du tout.

Modifié par aixur

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La question que je pose à travers la question "est-ce qu'il y a vraiment confirmation qu'il y a un système clef/serrure spécifique", c'est "est-ce qu'il y a des expériences prouvant que telle amorce ne va pas se lier avec un ARN ou un ADN qui n'est pas celui qu'on cherche, et ce, même si l'amorce est longue".

Pas clef /serrure mais collage ou non, partiel ou total. Quand à un collage non spécifique oui, potentiellement n'importe quelle amorce peut se fixer sur quelque chose de non spécifique.

Exemple, on a un ADN d'humain identifié. On prend l'amorce. Est-ce qu'il y a des expériences montrant qu'en prenant de l'ADN d'une vache par exemple, on n'arrivera pas à le multiplier via méthode PCR en utilisant l'amorce de l'ADN humain. Expérience à faire avec l'ADN de nombreux animaux différents bien sur, pas seulement avec un seul animal. Expérience à faire aussi avec une soupe de cellule. Ca pourrait accroitre les chance de chopper un truc qui va se lier avec l'amorce.

Fondamentalement oui ça peut arriver mais ça dépend de la séquence de l'amorce, si la séquence est conservée entre l'homme et l'animal etc.....tu peux même mais pour des gènes extrêmement conservés (c'est rare) amplifier une séquence de levure avec une amorce faite pour l'ADN humain. Mai sça c'est de la théorie, en pratique si l'appariement n'est pas parfait entre l'amorce et l'ADN ou ARN tu vas fair sauter cet appariement en augmentant la température d'hybridation lors de la PCR et là c'est souvent radical.

Ensuite si tu appliques cela à la détection d'un agent infectieux (car j'imagine que c'est ça icon_wink.gif ) ton contrôle négatif avec cellules non infectées est là pour te dire si c'est spécifique.

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(Nico111 @ Dimanche 05 Février 2006, 20:52)

Pas clef /serrure mais collage ou non, partiel ou total. Quand à un collage non spécifique oui, potentiellement n'importe quelle amorce peut se fixer sur quelque chose de non spécifique.

Fondamentalement oui ça peut arriver mais ça dépend de la séquence de l'amorce, si la séquence est conservée entre l'homme et l'animal etc.....tu peux même mais pour des gènes extrêmement conservés (c'est rare) amplifier une séquence de levure avec une amorce faite pour l'ADN humain. Mai sça c'est de la théorie, en pratique si l'appariement n'est pas parfait entre l'amorce et l'ADN ou ARN tu vas fair sauter cet appariement en augmentant la température d'hybridation lors de la PCR et là c'est souvent radical.

Oui, donc, ça pose problème quand même, non ? Si on peut amplifier une séquence de levure avec une amorce faite pour l'ADN humain, c'est un peu gênant tout de même (même s'il faut que le gène ait été bien conservé).

Le fait que la chaleur fasse sauter la liaison si celle-ci n'est pas parfaite, c'est la théorie. Faudrait là aussi voir s'il y a des documents le confirmant (je ne parle pas dans l'absolu, bien sur, mais dans les conditions de l'expérience, c'est à dire qu'on a des ADN cibles identifiés qui ne vont pas se détacher de l'amorce à la température T et des ADN non cibles qui se sont liés avec les amorces et qui vont s'en détacher à la dite température T). Il est tout à fait possible qu'un certain nombre de liaisons non voulues reste en place. Et quand on travaille avec si peu de matériel génétique, la moindre incertitude peut tout foutre en l'air.

Si on estime qu'il y a 100 cellules dans la soupe qu'on analyse et que les amorces puissent se lier à 100 ou 200 cellules par erreur, ben, au final, il se peut très bien qu'il n'y ait eu aucune cellule telle que celle qu'on recherchait et que tout ce qui a été amplifié l'ait été par erreur.

Ensuite si tu appliques cela à la détection d'un agent infectieux (car j'imagine que c'est ça icon_wink.gif ) ton contrôle négatif avec cellules non infectées est là pour te dire si c'est spécifique.

Oui, mais ça c'est en labo, lorsqu'on met au point la méthode PCR pour tel ADN ou ARN. Et on va se concentrer sur les cellules cibles (exemple, les cd4), pas sur une soupe de cellules (avec potentiellement d'autres cellulles que les cd4) et de débris divers. Pour savoir si c'est spécifique, il faudrait analyser des tonnes de cellules et débris différents. Je ne pense pas qu'on fasse ça.

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Oui, donc, ça pose problème quand même, non ? Si on peut amplifier une séquence de levure avec une amorce faite pour l'ADN humain, c'est un peu gênant tout de même (même s'il faut que le gène ait été bien conservé).

Lol ouais possible dans de très rares cas et encore. C'est marrant parce que globalement ce que tu me dis là c'est la théorie et en pratique je te dirais que non, on ne détecte pas comme ça n'importe quoi , quelques réglages et on élimine le plus souvent les contaminants.

Le fait que la chaleur fasse sauter la liaison si celle-ci n'est pas parfaite, c'est la théorie.

Théorie oui mais je peux t'assurer q'un seul malheureux degré peut faire qu'on obtient ce que l'on veut ou rien du tout.

Faudrait là aussi voir s'il y a des documents le confirmant (je ne parle pas dans l'absolu, bien sur, mais dans les conditions de l'expérience, c'est à dire qu'on a des ADN cibles identifiés qui ne vont pas se détacher de l'amorce à la température T et des ADN non cibles qui se sont liés avec les amorces et qui vont s'en détacher à la dite température T). Il est tout à fait possible qu'un certain nombre de liaisons non voulues reste en place. Et quand on travaille avec si peu de matériel génétique, la moindre incertitude peut tout foutre en l'air.

Plus tu augmentes la temp. plus tu es spécifique car un mauvais appariement de ton amorce sur las séquence cible va sauter de plus en plus facilement et c'est drastique. La faible quantité de matériel n'est pas un problème (jusqu'à un certain point bien sur) car la PCR fait 2puissanceN copies par pcr avec n=nombre de cycles et la moyenne c'est 30 alors fait un peu le calcul même en partant de 10 copies de ce que tu recherches. Encore une fois le problème c'est les amorces et leur spécificité, la méthode PCR n'est pas en cause.

Si on estime qu'il y a 100 cellules dans la soupe qu'on analyse et que les amorces puissent se lier à 100 ou 200 cellules par erreur, ben, au final, il se peut très bien qu'il n'y ait eu aucune cellule telle que celle qu'on recherchait et que tout ce qui a été amplifié l'ait été par erreur.

???? pareil, amorces sont elles spécifiques de ce que tu cherches et as tu fais les bons réglages, en plus le contrôle négatif est là pour savoir si tu es spécifique ou pas. Quant au fait que ce soit une soupe de cellules avec pleins de trucs aucuns problèmes le plus souvent, avec les bonnes amorce c'est ultra spécifique. Nous, on fait des RT pcr de cellules infectées et même de broyat d'organes infectées et dans la bouillie d'ARN extraits on obtient spécifiquement ce qu el'on cherche du matériel génétique du virus, sans bande contaminante.

Oui, mais ça c'est en labo, lorsqu'on met au point la méthode PCR pour tel ADN ou ARN. Et on va se concentrer sur les cellules cibles (exemple, les cd4), pas sur une soupe de cellules (avec potentiellement d'autres cellulles que les cd4) et de débris divers. Pour savoir si c'est spécifique, il faudrait analyser des tonnes de cellules et débris différents. Je ne pense pas qu'on fasse ça.

Et alors les techniques de diagnostic sont élaborées en labo d'abord sur des lignées cellulaires infectées puis on passe aux organes d'animaux infectés puis on finit avec des échantillons de fluides ou de tissus de personnes infectées (par exemple) pour vérifier le test , sa spécificité etc......Ici on va dire que HIV infecte principalement les T4 donc on prend le sang d'un patient, on isole les cellules et on extrait l'ARN (ça c'est de la soupe non?) et on pratique la PCR. Tu veux aller voir d'autres cellules ? soit mais quel est l'intérêt si le virus ne les infecte pas ? tu vas me dire et si on détecte un signal non spé dans ces cellules ? eh bien c'est que les amorces ne sont pas si spé que ça mais en quoi ça remet en question le test sur le T4 SI avec des T4 non infectés on n'obtient rien en PCR ????? Bien sur il faut savoir sur quoi on travaille, si le VIH n'existe pas ou ne provoque pas cette pathologie alors ton test ne veut rien dire, il reflète effectivement autre chose (stress oxydatif, apoptose, etc.....) mais la technique de PCR est hors de cause, ce n'est qu'un outil très puissant, à toi de te débrouiller pour avoi rquelque chose de spécifique et de propre, de savoir sur quoi tu travaille et si l'hypothèse de travail est fausse forcément ça fout le test en l'air, pas la technique..

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(Nico111 @ Jeudi 16 Février 2006, 19:31)

Lol ouais possible dans de très rares cas et encore. C'est marrant parce que globalement ce que tu me dis là c'est la théorie et en pratique je te dirais que non, on ne détecte pas comme ça n'importe quoi , quelques réglages et on élimine le plus souvent les contaminants.

Ben, je sais pas, c'est toi qui me dis qu'on peut "amplifier une séquence de levure avec une amorce faite pour l'ADN humain". Et là, il ne s'agit pas de contaminant, mais simplement du fait que la méthode PCR n'est pas spécifique (ou pas assez).

Théorie oui mais je peux t'assurer q'un seul malheureux degré peut faire qu'on obtient ce que l'on veut ou rien du tout.

Ben justement. Si l'écart de température entre l'obtention de ce que l'on veut et le rien du tout est si faible, la fourchette dans laquelle se joue le fait que le lien imparfait saute ou pas est extrêmement réduite. Donc, on ne doit pas tellement pouvoir jouer sur la température pour éliminer les mauvaises liaisons tout en gardant celles avec les ADN cibles.

Mais, quand même, on ne fait pas l'expérience avec tous les ADN ou ARN qui pourraient se lier avec l'ADN ou ARN amorce. Donc, ce que tu me dis, c'est de la théorie. Avec certains ADN, c'est possible, mais avec d'autres, peut-être pas. Et comme on ne test pas tous les ADN ou ARN...

La faible quantité de matériel n'est pas un problème (jusqu'à un certain point bien sur) car la PCR fait 2puissanceN copies par pcr avec n=nombre de cycles et la moyenne c'est 30 alors fait un peu le calcul même en partant de 10 copies de ce que tu recherches. Encore une fois le problème c'est les amorces et leur spécificité, la méthode PCR n'est pas en cause.

Non, quand j'ai dis "Et quand on travaille avec si peu de matériel génétique, la moindre incertitude peut tout foutre en l'air", c'était relié à ce qui venait après. Ce que je dis, c'est, supposons que tu as des ADN cibles et des ADN non cibles et que l'amorce se lie aussi bien avec l'un qu'avec l'autre. Le problème c'est que tu as très peu de chacun d'entre eux. Alors, il se peut très bien qu'il n'y ait que l'ADN non cible en fait. Et que malgré la température, l'ADN non cible reste lié avec l'amorce. Et là, tu obtiens un résultat alors qu'il n'y a pas d'ADN cible au départ. Le fait qu'il y ait très peu de matériel fait que ça peut se jouer à peu de choses. Il peut y avoir 10 ADN non cibles, et aucun ADN cible, mais la présence de l'ADN non cible, même en très faible quantité, fait réagir le test alors qu'il n'y a rien de ce qu'on cherche. Du coup, ça entraine une forte incertitude sur la validité des résultats.

???? pareil, amorces sont elles spécifiques de ce que tu cherches et as tu fais les bons réglages, en plus le contrôle négatif est là pour savoir si tu es spécifique ou pas. Quant au fait que ce soit une soupe de cellules avec pleins de trucs aucuns problèmes le plus souvent, avec les bonnes amorce c'est ultra spécifique. Nous, on fait des RT pcr de cellules infectées et même de broyat d'organes infectées et dans la bouillie d'ARN extraits on obtient spécifiquement ce qu el'on cherche du matériel génétique du virus, sans bande contaminante.

Le problème, c'est que, pour savoir si les amorces sont spécifiques de ce que tu recherches, il faut tester je ne sais pas combien de millier ou de centaines de milliers d'ADN ou ARN différents. Tu ne peux pas dire que ton amorce est spécifique tant que tu n'as pas montré qu'elle ne réagit pas avec d'autres ADN ou ARN.

Le controle, il se fait avec très peu de cellules différentes je suppose (parce que la culture de cellule n'en contient pas énorméments de différentes a priori. Et c'est encore pire si c'est basé sur des échantillons filtrés pour n'avoir que des particules de taille virale) Donc, impossible de savoir si, dans des conditions où il y aurait beaucoup de cellules différentes (un test de charge virale par exemple), il n'y aurait pas d'autres ADN ou ARN faisant réagir le test.

Tu parles de broyats d'organes infectés, seulement, est-ce qu'à ce moment là, on fait des tests de controle avec un autre broyat ? Et même avec beaucoup d'autres broyats ? Parce que, si ça se joue avec très peu de cellules, un échantillon peut aussi ne pas en contenir.

Sinon, qu'est-ce que tu entends par bande contaminante ?

Et alors les techniques de diagnostic sont élaborées en labo d'abord sur des lignées cellulaires infectées puis on passe aux organes d'animaux infectés puis on finit avec des échantillons de fluides ou de tissus de personnes infectées (par exemple) pour vérifier le test , sa spécificité etc......Ici on va dire que HIV infecte principalement les T4 donc on prend le sang d'un patient, on isole les cellules et on extrait l'ARN (ça c'est de la soupe non?) et on pratique la PCR. Tu veux aller voir d'autres cellules ? soit mais quel est l'intérêt si le virus ne les infecte pas ? tu vas me dire et si on détecte un signal non spé dans ces cellules ? eh bien c'est que les amorces ne sont pas si spé que ça mais en quoi ça remet en question le test sur le T4 SI avec des T4 non infectés on n'obtient rien en PCR ????? Bien sur il faut savoir sur quoi on travaille, si le VIH n'existe pas ou ne provoque pas cette pathologie alors ton test ne veut rien dire, il reflète effectivement autre chose (stress oxydatif, apoptose, etc.....) mais la technique de PCR est hors de cause, ce n'est qu'un outil très puissant, à toi de te débrouiller pour avoi rquelque chose de spécifique et de propre, de savoir sur quoi tu travaille et si l'hypothèse de travail est fausse forcément ça fout le test en l'air, pas la technique..

Ce qui pose encore le problème des échantillons de controle et de leur nombre. On peut tomber sur une échantillon de controle qui ne va pas réagir. Il faudrait donc plusieurs centaines d'échantillons de controle pour être sur qu'on a bien un truc spécifique.

Et se pose apparemment le problème des différentes étapes de vérification (étape 1 : culture de cellule, étape 2 : broyat d'animaux, étape 3 : sang d'animaux ou de personnes lambdas), du nombre de cellules différentes impliquée et aussi du nombre d'échantillons de controle à chaque niveau. Au niveau de la lignée cellulaire, il va probablement y avoir peu de cellules différentes (susceptibles de réagir avec les amorces alors que ce ne sont pas des ADN cibles), ce qui rend moins valable la procédure de controle. On peut penser aussi que le nombre d'échantillons non infectés reste assez faible. Rendant là aussi moins valable la procédure de controle.

Cela dit, le problème de cette défense, c'est que quelque soit la cause qui fait réagir la PCR faussement (une particule de stress présente chez beaucoup de monde, ou le fait que la methode PCR réagit avec un peu n'importe quoi), le fait que la PCR réagit faussement positive chez des individus qui n'ont pas le virus, normalement, ça devrait se répercuter sur le stade 1 (l'étape de la culture de cellules), et on devrait avoir des cultures de controle qui devraient réagir positives à la PCR. Parce qu'elles devraient posséder aussi ces particules de stress. Donc, si la PCR ne réagit pas sur les cultures de controle, c'est qu'il y a un problème, soit dans la méthode PCR, soit dans la culture de controle, soit dans la façon de faire des expérimentateurs. Ou alors, ils ne pratiquent pas la méthode PCR sur l'échantillon de controle.

Selon ce que tu dis, il ne peut pas y avoir de faux positifs avec la méthode PCR, quelque soit l'étape (culture de cellules, broyat d'animaux de laboratoire, échantillons sanguins d'animal ou d'humain lambas). Selon toi, la méthode PCR est ultra spécifique. Donc, comme il est clair qu'il y a des faux positifs dans le cas des séropositifs au VIH (des gens qui n'ont jamais été en contact avec le virus ont une charge virale), soit c'est parce que la chose qu'on détecte n'est pas virale (une particule de stress par exemple, ou autre chose), soit parce que la méthode PCR déconne. Selon toi, dans ce cas, c'est forcément parce que la méthode PCR ne détecte par un virus mais une particule autre. Donc, pour toi, la méthode PCR reste valable. Seulement, le problème, c'est que ça devrait se répercuter aux étape antérieures. Il y a des particules de stress dans les broyats et dans les cultures de cellules, puisqu'on détecte quelque chose avec le test PCR (la même chose que ce qu'on détecte chez des individus lambdas). Donc, il n'y a pas de problème d'absence de ces particules à ces étapes là. Et du coup, on ne voit pas pourquoi il n'y aurait pas de particules de stress dans les broyats et dans les cultures de cellules de controle (puisque ce sont des particules endogènes, des conditions similaires de culture devraient produire les mêms particules). Et donc, on ne voit pas pourquoi la PCR ne réagirait pas aussi dans les échantillons de controle. Si ça ne le fait pas, c'est donc bien qu'il y a un problème avec la méthode PCR, ou alors dans le protocole d'expérimentation ou alors, parce qu'on n'applique pas la méthode PCR aux échantillons de controle, ou alors, qu'il n'y a tout simplement pas d'échantillon de controle.

Donc, il y a un problème sur l'expérience faite avec les cultures de cellules (et les broyats). Et comme, selon toi, la méthodologie est standardisée et donc reprise par tous les virologues, et que les expérimentateurs sont des gens sérieux, si ça déconne pour le VIH, ça peut déconner potentiellement partout, sur toutes les expériences faites avec des virus.

Bref, s'il y a des faux positifs à une des étapes, qui impliquent que les particules sont endogènes, il doit y en avoir à toutes les étapes. Ou alors, c'est qu'il y a un problème dans le protocole expérimental.

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Ben, je sais pas, c'est toi qui me dis qu'on peut "amplifier une séquence de levure avec une amorce faite pour l'ADN humain". Et là, il ne s'agit pas de contaminant, mais simplement du fait que la méthode PCR n'est pas spécifique (ou pas assez).

Dans de TRES rares cas de protéines très conservées. Ce n'est pas que ta méthode PCR en soi n'est pas spécifique, c'est que tu as utilisé des amorces qui amplifient une protéine conservée entre la levure et l'homme (et encore il faut tomber dessus car la séquence n'est pas 100% identique).

Ben justement. Si l'écart de température entre l'obtention de ce que l'on veut et le rien du tout est si faible, la fourchette dans laquelle se joue le fait que le lien imparfait saute ou pas est extrêmement réduite. Donc, on ne doit pas tellement pouvoir jouer sur la température pour éliminer les mauvaises liaisons tout en gardant celles avec les ADN cibles.

Les cas de figures sont multiples. Moi par exemple,en général, si j'amplifie des morceaux de virus à 40 degrés pour l'hybridation j'ai du non spécifique. A 45 moins de bandes spé , à 50 plus de non spé , à 55 en général j'obtiens toujours la bande d'ADN que j'attend sans bande contaminante non spé. Donc un petit écart de temp peut beaucoup jouer mais si tu continues à augmenter la temp ta réaction marche toujours et tu n'as plus de non spé donc c'est bon.

Mais, quand même, on ne fait pas l'expérience avec tous les ADN ou ARN qui pourraient se lier avec l'ADN ou ARN amorce

On travaille sur environ 5 à 10 lignées de céllules différentes plus sur moustiques et rats/souris. Quand on extrait l'ARN global de cellules ou de tissus infectés on a beacoup mais beaucoup plus d'ARN des cellules que d'ARN viruax (au moins 1000 fois plus) mais ça n'em^peche pas d'obtenir uniquement ce qu'on cherche avec les amorces spé et la bonne temp. Contrôle nég non infecté ne donne rien bien sur. Ca te suffit ?

Ce que je dis, c'est, supposons que tu as des ADN cibles et des ADN non cibles et que l'amorce se lie aussi bien avec l'un qu'avec l'autre

Alors t'es mal barré ! faut changer l'amorce.

Alors, il se peut très bien qu'il n'y ait que l'ADN non cible en fait. Et que malgré la température, l'ADN non cible reste lié avec l'amorce. Et là, tu obtiens un résultat alors qu'il n'y a pas d'ADN cible au départ. Le fait qu'il y ait très peu de matériel fait que ça peut se jouer à peu de choses. Il peut y avoir 10 ADN non cibles, et aucun ADN cible, mais la présence de l'ADN non cible, même en très faible quantité, fait réagir le test alors qu'il n'y a rien de ce qu'on cherche. Du coup, ça entraine une forte incertitude sur la validité des résultats.

Oui mais là tu supposes que les amorces ne sont pas spé donc c'est de toute façon mort. d'où la présence des contrôles négatifs non infectés, non malades. Si ça sort aussi avec ta PCR alors amorces à la poubelle et si tu suppose que l'amorce au lieu d'être spécifique du pathogène ne fait que cibler des ARN cellulaires en fait alors bien sur ta manip ne veut rien dire, tu ressortiras tout le temps une réaction positive.

Le problème, c'est que, pour savoir si les amorces sont spécifiques de ce que tu recherches, il faut tester je ne sais pas combien de millier ou de centaines de milliers d'ADN ou ARN différents. Tu ne peux pas dire que ton amorce est spécifique tant que tu n'as pas montré qu'elle ne réagit pas avec d'autres ADN ou ARN.

Voir ci-dessus on a plein de cellules différentes et un extrait d'ARN cellulaire contient des milliers, milions ? d'ARN différents.

dans des conditions où il y aurait beaucoup de cellules différentes (un test de charge virale par exemple), il n'y aurait pas d'autres ADN ou ARN faisant réagir le test.

Il ya beaucoup de cellules différentes lors du test de charge viral ? Bof pas tant que ça. Ce test se fait par PCR quantitative je crois mais je ne sais pas le protocole précis. De toute façon idem il suffit de faire le contrôle avec des échantillons que l'on suppose non infecté. Si c'est aussi positif alors test à la poubelle.

Tu parles de broyats d'organes infectés, seulement, est-ce qu'à ce moment là, on fait des tests de controle avec un autre broyat ? Et même avec beaucoup d'autres broyats ? Parce que, si ça se joue avec très peu de cellules, un échantillon peut aussi ne pas en contenir.

Lol à ton avis ????????? en général on travaille par lot de 3 souris, non infectées , infectées etc..... Sur cerveau, rate , foie rein, poumon et autre encore. Et ça a été fait et refait.

Sinon, qu'est-ce que tu entends par bande contaminante ?

En PCR basique, je veux par exemple détecter si mon virus est là, je prend deux amorces qui hybrident dans son ARN . Si ça marche je dois obtenir une bande d'ADN après RT PCR d'une taille X par rapport à ce que j esais de son génome . Quand je fais migrer la RT PCR sur un gel d'agarose pour séparer en fonction de la taille les morceaux d4ADN éventuellement amplifiés je dois obtenir une bande à la taille X. Si j'ai autre chose à d'autre taille ça doit être soit une amplification non spé ou alors que je n'ai amplifié qu'une partie de l'ARN que je recheche. A voir avec le contrôle nég.

Ce qui pose encore le problème des échantillons de controle et de leur nombre. On peut tomber sur une échantillon de controle qui ne va pas réagir. Il faudrait donc plusieurs centaines d'échantillons de controle pour être sur qu'on a bien un truc spécifique.

Ton échantillon de contrôle te donne du positif ? alors manip à la poubelle et tu refais. Quant à établir un diagnostic eh bien oui il faut tester avec pleins d'échantillons (au - 500-1000 en général)

Selon ce que tu dis, il ne peut pas y avoir de faux positifs avec la méthode PCR, quelque soit l'étape (culture de cellules, broyat d'animaux de laboratoire, échantillons sanguins d'animal ou d'humain lambas)

Non on peux avoir du faux positif, on peut ne jamais se débarasser de bandes cobtaminantes malgré des amorces spé. A toi alors de changer d'amorce ou de conditions de PCR.

Donc, comme il est clair qu'il y a des faux positifs dans le cas des séropositifs au VIH (des gens qui n'ont jamais été en contact avec le virus ont une charge virale), soit c'est parce que la chose qu'on détecte n'est pas virale (une particule de stress par exemple, ou autre chose), soit parce que la méthode PCR déconne

OUi parce que tes amorces ne sont pas complètement spé par exemple. Si ta PCR peut être positive si un autre pathogène infecte les cellules ç'est un autre problème. Si tes cellules sont absolument saine et que c'est positif alors test à la poubelle.

Au niveau de la lignée cellulaire, il va probablement y avoir peu de cellules différentes (susceptibles de réagir avec les amorces alors que ce ne sont pas des ADN cibles), ce qui rend moins valable la procédure de controle. On peut penser aussi que le nombre d'échantillons non infectés reste assez faible. Rendant là aussi moins valable la procédure de controle.

non si tu trouves pareil avec les animaux infectés, et en plus tu ne fais pas qu'une PCR tu fais plein d'autres test sur les protiénes virales , si un effet destructeur des cellules, etc...ça ne repose pas que sur un pauvre test PCR , on ne fais un diagnostic que quand le virus est bien caractérisé. S'il ne l'est pas bien sur.......

Selon toi, dans ce cas, c'est forcément parce que la méthode PCR ne détecte par un virus mais une particule autre. Donc, pour toi, la méthode PCR reste valable.

ce sont tes amorces qui ciblent autre chose. Il faut en changer , vu la taille du génome viral c'est possible. Si tu n'y arrives pas, et que c'est toujours positif alors il faut se poser des questions sur la validité de ton virus.

selon ce que tu dis, il ne peut pas y avoir de faux positifs avec la méthode PCR, quelque soit l'étape (culture de cellules, broyat d'animaux de laboratoire, échantillons sanguins d'animal ou d'humain lambas). Selon toi, la méthode PCR est ultra spécifique. Donc, comme il est clair qu'il y a des faux positifs dans le cas des séropositifs au VIH (des gens qui n'ont jamais été en contact avec le virus ont une charge virale), soit c'est parce que la chose qu'on détecte n'est pas virale (une particule de stress par exemple, ou autre chose), soit parce que la méthode PCR déconne. Selon toi, dans ce cas, c'est forcément parce que la méthode PCR ne détecte par un virus mais une particule autre. Donc, pour toi, la méthode PCR reste valable. Seulement, le problème, c'est que ça devrait se répercuter aux étape antérieures. Il y a des particules de stress dans les broyats et dans les cultures de cellules, puisqu'on détecte quelque chose avec le test PCR (la même chose que ce qu'on détecte chez des individus lambdas). Donc, il n'y a pas de problème d'absence de ces particules à ces étapes là. Et du coup, on ne voit pas pourquoi il n'y aurait pas de particules de stress dans les broyats et dans les cultures de cellules de controle (puisque ce sont des particules endogènes, des conditions similaires de culture devraient produire les mêms particules). Et donc, on ne voit pas pourquoi la PCR ne réagirait pas aussi dans les échantillons de controle. Si ça ne le fait pas, c'est donc bien qu'il y a un problème avec la méthode PCR, ou alors dans le protocole d'expérimentation ou alors, parce qu'on n'applique pas la méthode PCR aux échantillons de controle, ou alors, qu'il n'y a tout simplement pas d'échantillon de controle.

Je suis désolé si je radotte, j'ai l'impression de répéter la même chose. J'ai du mal à te répondre ou me faire comprendre il me semble car là ton raisonnement fait comme si tous les contrôles étaient positifs. Certaines personnes répondent positifs à ce test alors qu'ils ne sont pas infectés mais pour autant c'est une très faible partie parmi les personnes testées et les raisons peuvent être multiples. Si lors de la mise au point de ton test les echantilons non infectés sont négatifs, si tu as des faux positifs ensuite alors c'est que le patient a surement un problème (stress particulier, infection autre , médoc etc...) mais il ne faut pas s'arrêter qu'à un seul test , on doit regarder les symptomes + différents tests.

Donc, il y a un problème sur l'expérience faite avec les cultures de cellules (et les broyats)

Perso j e n'en ai pas.

Et comme, selon toi, la méthodologie est standardisée et donc reprise par tous les virologues

La PCR est une méthode mais il faut adapter les amorces les conditions etc.....

et que les expérimentateurs sont des gens sérieux

Faut espérer mais comme d'hab le 100% n'existe pas!

si ça déconne pour le VIH, ça peut déconner potentiellement partout, sur toutes les expériences faites avec des virus.

Pas sur un travail expériemental en général .Qu'il y ait un très faible % de faux positifs dans des échantillons de diagnoqtic ? oui la bio ce n'est pas un science exacte, il faut identifier les sources de faux positifs. Si ta spécificité de diagnostic est par exemple de plus de 95 % = moins de 5% de faux + dans les test (c'est environ le mini accepté je crois) c'est bon non ?

Je m'arrête , il est tard , j'ai peur de ne pas avoir su me faire bien comprendre mais bon ne pas hésiter à me faire préciser.

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Je reviendrais plus tard sur le reste. Revenons au coeur du problème soulevé dans mon dernier message. Tu me réponds donc que la méthode PCR est géniale, qu'elle est super spécifique. Donc, aucun problème avec la méthode PCR. Et à toutes les étapes du truc, il n'y a aucun problème ou si peu. Et tu dis que tes expériences montrent que ce que tu obtiens est forcément une chose virale, puisque on ne retrouve pas dans l'échantillon de controle, ce qu'on trouve dans l'échantillon ou est sensé être le virus.

Et comme les virologues ont des méthodes standardisées et que ce sont des gens sérieux, la même chose a été faite pour le VIH et est même faite quasi quotidiennement pour l'étudier.

Seulement voilà, pour le VIH, on sait qu'il y a des gens qui ont une charge virale, alors qu'il n'ont aucune raison d'avoir le "virus" en eux. Eh oui, vu que c'est une MST qui ne se transmet pas facilement, c'est facile de déterminer que certaines personnes n'ont clairement pas été en contact avec le supposé virus. Donc, puisque, selon toi, la méthode PCR est super spécifique, ben, ce qu'on a identifié chez ces gens, c'est exactement la même chose que ce qu'on a identifié dans les cultures de cellules. Problème : la chose en question est clairement un élément endogène puisque des gens qui ne sont clairement pas en contact avec le "virus", possèdent cette chose dans leur sang. Et ça, ça fout le bordel pour l'interprétation officielle, parce que, si cette particule est endogène, sa présence est du coup liée aux conditions dans lesquelles vivent les cellules. Donc, lors de l'étape 1, celle où on cultive les cellules, si les conditions de culture sont les mêmes, normalement, on devrait retrouver des particules, aussi bien dans la culture du "virus", que dans la culture de controle (sans "virus"). Or, d'après ce que tu dis, ça n'arrive apparemment pas.

Donc, soit il y a un problème dans la méthode PCR, soit dans le protocole de l'expérience, soit dans la façon d'appliquer le protocole ou un des deux ou les trois.

Eh oui, les 3 étapes (culture de cellule, broyat, et mesure PCR sur la population) étant liées, il suffit qu'une seule montre que la particule recherchée est endogène pour que les deux autres étapes soient invalidées en tant que preuve d'un agent exogène viral. Et là dedans, il est clair que c'est la troisième étape qui est le maillon faible. Tant qu'on reste dans les labos avec des gens qui peuvent soutenir que tout va bien madame la marquise et qu'il n'y a aucun défaut à la méthode, difficile de savoir ce qu'il en est. Mais, avec la troisième étape, ce biais disparait, et on peut voir que les méthode décrites comme correctes sont loin de l'être.

Bref, ça m'étonnerais beaucoup que tes expériences soient si nickel que ça.

Dans tout ça, ce qui pourrait être sauvé, paradoxalement, c'est la méthode PCR. Puisqu'elle pourrait être valable (parce que spécifique) et le protocole d'expérimentation non valable. Alors que l'inverse n'est pas vrai. A priori, c'est plutot le protocole de culture du "virus" ou son application qui pose problème. Mais, si le protocole ou la façon de l'appliquer a un défaut fatal, alors, le doute est porté sur le reste des méthodes utilisées, dont la méthode PCR.

Modifié par aixur

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