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Failles dans la méthode d'isolement des virus


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112 réponses à ce sujet

#1 aixur

aixur

    Chercheur de quoi déjà ?

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Posté 11 août 2005 - 19:29

Ca y'est, je crois que je vois où se situent les faiblesses de la procédure d'isolement des virus.

En fait, je crois que le problème se situe dans la culture de cellules in vitro : cette méthode produit plein de débris celllulaires d'une taille comprise au moins entre 50 et 500 nm. Ca entraine que les particules de taille virales ne représentent qu'un faible pourcentage du total du matériel purifié. Ca entraine surtout qu'on doit toujours trouver quelque chose quand on cherche un virus. Et ça entraine donc que les expériences de controle sont non valides et ne doivent pas être faites puisqu'elle ne peuvent être que positives.

Si on fait une expérience de controle, que va-t-il se passer ? Comme la culture de cellules produit des particules de tailles comprises entre 50 et 500 nm, il va très probablement y avoir aussi des particules d'une taille comprises entre 100 et 120 nm, taille à laquelle on considère que les particules sont virales. Donc, l'expérience de controle va montrer qu'il y a production de particules de taille virale, donc qu'il y a des virus. Ca va être vrai si on utilise le microscope électronique, ça va l'être encore plus si on utilise simplement la méthode des gradians de densité, qui ne permet pas de faire la différence entre les particules de taille de 100-120 nm et celles de 50-500 nm. Donc, puisque l'expérience de controle est toujours positive (on trouve du virus) on ne va probablement pas en réaliser lorsqu'on utilise une culture de cellules. Donc, sans expérience de controle, la méthode d'isolement du virus est non valide.

La seule situation où on va pouvoir faire une expérience de controle, je pense, c'est si on prend du sang directement d'une personne malade et d'une personne non malade. Il est possible qu'une personne non malade ne possède pas de particules de taille virale dans son sang. Donc, dans ce cas, on va éventuellement pouvoir conduire une expérience de controle. Ce qui servira à justifier de l'existence de ce genre d'expérience par ailleurs. On pourra dire "si si, on fait des expériences de controle". Mais on oubliera de dire qu'avec une culture de cellule, on n'en fait pas. Ce qui change tout. Parce qu'il n'y a que la culture de cellule qui permet de dire qu'il y a réplication des particules de taille virale.

Ce qui crée en partie un écran de fumée sur la validité de l'isolement quand on lit des documents sur les procédures d'isolement de virus, c'est le fait qu'on nous dit qu'on obtient des cultures purifiées à 99 %. Il y a 99 % de particules de même taille et de même forme dans ces échantillons purifiés. Donc, on pense que 1) la méthode de purification par ultricentrifugation et gradient de densité est très précise et 2) que la méthode d'isolement globale est bonne ; vu qu'on a réussi à obtenir 99 % de particules d'une taille comprise entre 100 et 120 nm.

Alors, pourquoi touve-t-on des purifications pures à 99 % ? Je pense que c'est parce qu'il y a énormément de particules de tailles virales dans le sang dans le cas de certaines maladies. En effet, les purification pures à 99 % semblent toutes venir directement du sang d'une personne ou d'un animal (ou de la sève d'une plante), sans qu'il y ait besoin de faire une culture de cellules avec ce sang. Et peut-être bien que dans le sang, il y a beaucoup moins de débris cellulaires comme il y en a dans les cultures cancérisées. Donc, s'il y a beaucoup de particules de tailles virales, on va réussir à en trouver 99 % dans la filtration. Tandis que quand on fait des culture cancérisées, certaines cellules doivent mourir et alors, exploser ou se décomposer, et engendrer tout un tas de débris sédimentant à la taille du matériel viral. Donc, on a 99 % de matériel de taille virale dans un cas de figure tout à fait particulier.

Et on va avoir des échantillons purs à 99 %, mais seulement à la première étape de l'ensemble de la procédure (qui inclue 1er isolement directement du sang du patient ou avec une culture de cellules, puis réplication du virus avec une culture de cellules et enfin, isolement du virus "répliqué"). Et ceci, seulement pour certaines maladies je suppose. Pour ces cas là, il y a déjà beaucoup de particules d'une taille comprise entre 100 et 120 nm dans le sang et peu de particules de tailles inférieures ou supérieures. Donc, on va obtenir un échantillon purifié très pur. Et le test de controle avec des personnes, des animaux ou des plantes non malades va donner un échantillon sans grand chose dedans. Donc, à la première étape, les choses sont clean, lisses. Aucune aspérité ne vient troubler l'idée que la méthode est bonne.

C'est lors de la deuxième étape (qui peut devenir par certains cotés la première si l'obtention d'un résultat est difficile avec la première étape) que les problèmes apparaissent. Lors de cette deuxième phase, il faut passer par une culture de cellules. Le problème, c'est que cette culture de cellule engendre plein de débris cellulaires de tailles diverses, dont des tailles comprises entre 50 et 500 nm (suivez mon regard). Donc, apparait un problème avec la méthode de purification par gradiant de sucrose. Vu que la méthode n'est pas assez précise, les particules de taille virale (100-120 nm), sont forcément noyées parmi plein d'autres. Donc, avec une culture de cellule, on ne peut plus avoir une purification pure à 99 %. Et également, on a quasiment obligatoirement un résultat positif (c'est à dire qu'on trouve forcément quelque chose avec la méthode des gradiants de sucrose), avec ou sans introduction de virus. Donc, impossible d'avoir un test de controle, vu qu'on va forcément trouver quelque chose aussi avec le test de controle. Donc, on ne peut pas faire de test de controle. Donc, impossible de savoir si les particules virales identifiées lors de la première étape se répliquent vraiment ou si elles sont produites par les cellules vu qu'on ne sait pas si dans un échantillon sain, sans virus, il y aurait production de virus par les cellules ou pas. En d'autres termes, impossible de savoir si 1) le virus est endogène et produit par les cellules, sans qu'il y ait besoin qu'on introduise un virus au départ ; ou 2) s'il s'agit simplement de débris cellulaires ; ou 3) s'il est exogène et réplicant.

Donc, on ne peut avoir 99 % de matériel de taille virale que lors de la première étape. Dès la deuxième étape (quand il y a culture de cellules), ce n'est plus le cas.

Par ailleurs, au passage, petit détail, il semble bien qu'on ne compte pas les particules de taille virale lors de l'introduction dans la culture de cellule et après purification. Donc, impossible de savoir s'il y a vraiment eu augmentation du nombre de ces particules et donc, s'il y a eu réplication.

Donc, en résumé :

1) La culture de cellules in vitro engendre des débris cellulaires d'une taille approchant celle des virus (entre 50 et 500 nm, alors que celle des virus est de 100-120 nm). Donc, on ne voit pas pourquoi ça ne produiraient pas des particules entre 100 et 120 nm. Donc, il doit toujours y avoir des particules de tailles virale de produites dans ces échantillons.

2) Donc, les tests de controle ne peuvent être conduits puisqu'ils ne peuvent réagir que dans un seul sens (positif), alors que la condition pour qu'ils puissent être considérés comme tests de controle est qu'ils puissent réagir positif ou négatif. On pourrait faire un test au microscope électronique. Mais dans la mesure où on doit toujours trouver du matériel de taille viral, je pense qu'on ne doit pas les faire (les seules fois où on doit les faire, c'est quand on analyse directement le sang de personnes malades et en bonne santé). Si on utilise la méthode moins précise de l'observation des bandes de gradient de densité de sucrose, alors là, vu tout le matériel autre que les particules de 100-120 nm qui sédimentent à l'endroit où sédimentent aussi les virus, on est encore plus sur d'obtenir toujours un résultat positif. Donc, rebelotte, on ne doit pas faire de test de controle.

3) Comme les tests de controle (qui doivent montrer qu'après culture sans virus, il n'y a toujours pas de virus) sont indispensables pour valider le travail d'isolement, et qu'on ne peut pas les réaliser, la méthode d'isolement n'est pas valable.

4) On ne peut donc pas dire que les particules de taille virales se réproduisent dans les cultures contaminées

5) L'obtention de cultures puririfiée pures à 99 % ne s'obtient, à mon avis, que quand on purifie directement le sang d'une personne. Dès qu'on passe par une culture de cellule, à priori, c'est foutu.

Si tout ça se confirme, la procédure n'est pas valable. Et toute la virologie est caduque (et pas seulement celle des 30 dernières années, comme l'avait montré de Harven).

Modifié par aixur, 11 août 2005 - 19:29 .


#2 aixur

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Posté 12 août 2005 - 11:31

Le hasard fait bien les choses. En présentant un début d'argumentaire sur Aids Myth Exposed, Chris, un des modérateurs, m'a renvoyé sur deux pdf présentant des travaux d'isolement de virus datant de 1973. L'un d'entre eux, celui de Toplin, va dans le sens de l'hypothèse que j'ai faite à propos du fait que les purifications pures à 99 % viennent à priori directement du sang, ou du plasma, etc..., d'une personne (ou d'un animal ou d'une plante).

A la fin de la page 2, il dit (traduction plus bas) : "in general, cell culture systems for the propagation of tumor viruses have the following advantages : Readily expandable volume, Control of contaminating viruses, Can swith to different viruses quickly, less cost per volume (not necessarily less cost per virus). In contrast, viremic animal fluids and tissues generally contain : higher virus concentrations, higher biological activity per virus particle, less cellular contamination (serum and plasma)."

Traduction "En général, les systèmes de culture de cellules pour la propagation des virus de tumeur ont les avantages suivant : volume aisément extensible, control de la contamination du virus, on peut passer à différents virus rapidement, moindre cout par volume (pas nécessairement moins de cout par virus). Par contre, les fluides et les tissus d'animaux contenant des virus contiennent généralement : une concentration en virus plus importante, une activité biologique plus élevée par particule de virus, moins de contamination cellulaire (serum et plasma)."

Donc, c'est bien ça. Les fluides venant directement des personnes ou des animaux contiennent une plus grande concentration en virus et une moins grande contamination cellulaire. Donc, il est clair qu'il est beaucoup plus facile d'obtenir une purification pure à 99 % avec ça.

C'est vrai que ce problème des 99 % n'est pas une faille en soi. Mais c'est tout de même très important. Parce que ça représente un très gros écran de fumée pour la compréhension des failles de la méthode d'isolement.

Sinon, sur le premier pdf, celui de fitoussi, je n'ai pas l'impression qu'il parle d'expérience de controle. Et il s'agit apparemment d'un isolement avec culture de cellules. Cela dit, le pdf est de très mauvaise qualité. Mais, j'ai quand même réussi à lire à peu près ce qu'il y avait. Donc, je ne pense pas me tromper.

La page vers les pdf : http://www.theperthg...ER/Spectra.html

Modifié par aixur, 12 août 2005 - 11:35 .


#3 Viduité

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Posté 12 août 2005 - 11:33

Aixur,

L'essentiel est de garder la santé ...

#4 aixur

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Posté 12 août 2005 - 11:36

Ca c'est sur. Mais, à mon avis, tout le monde la gadera beaucoup mieux quand on aura arrêté de donner des médicaments pour des virus qui n'existent pas.

Modifié par aixur, 12 août 2005 - 11:46 .


#5 Viduité

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Posté 12 août 2005 - 11:59

C'est mon avis aussi ... et d'ailleurs qu'il existe ou pas, c'est du pareil au même.

Tiens à propos, je me disais " mais pourquoi ont-ils porté la majorité de leurs intentions (mauvaises) sur l'afrique ? "

... et ça, ils l'ont fait quasi-immédiatement ...

La réponse est complexe car c'est bien là-bas que l'intérêt économique est le moins intéressant ... mais ils sont malins les bougres ... car ils se couvrent ainsi aux yeux du grand public (qui ne cherchent pas trop à comprendre) et organisent des flux financiers institutionnels (et les justifient) qui contre balancent les "manques à gagner" qui peuvent paraître évidents en première analyse ...

Par ailleurs, dans ces régimes fragiles (et corrompus) de post-colonisation, il est astucieux de reprendre la main d'une manière ou d'une autre.

Le seul hic (mais après tout leurs avis sont de peu d'importance), les africains de la rue s'en foutent ... et ceux de la campagne encore plus.

Je n'ai jamais vu un africain (sauf ceux qu'on salarie pour cela) gueuler pour l'accès au soin ... ça n'interpelle personne ça ... c'est bizarre non ?

#6 aixur

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Posté 13 août 2005 - 19:49

Pour en revenir aux tests de controle, qui sont donc LE problème des procédures d'isolement, il est évident que puisque c'est impossible à faire, soit on en fait pas (comme je l'avais dit plus haut), soit on les truande.

En faisant la traduction d'un texte du groupe de Perth sur l'isolement du VIH (the last debate), j'ai trouvé un exemple de test de controle. Il a été réalisé durant la procédure d'isolement du virus tentée (et non réussie évidemment) en 1997. Bon, comme on connait la fin de l'histoire, on sait que, forcément, la procédure de test de controle est bidon. Voici ce qu'en dit le groupe de Perth :

"La condition minimum, absolument nécessaire mais non suffisante, pour revendiquer que ce qui est appellé "des particules de VIH-1" est un retrovirus et pas des microvesicules cellulaires est de prouver que les fractions de densité de sucrose obtenues à partir des cellules "infectées" contiennent des protéines qui ne sont pas présentes dans les mêmes fractions obtenues à partir des cellules non infectées. Cependant, Bess et autres ont montré que ce n'est pas le cas. La seule différence qu'on peut voir dans leurs bandes d'électrophorèse de gel de SDS-polyacrylamide "de virus purifié" et de "faux virus" est quantitative, non qualitative. Cette différence quantitative peut être due à beaucoup de raisons, dont le fait qu'il y avait des différences significatives dans l'histoire et le mode de préparation des cultures de cellules H9 non infectées et "infectées"."


Donc, bien sur, il a finalement été montré (par des dissidents je suppose) qu'on obtient la même chose dans la purification venant de la culture sans virus que celle venant de la culture avec virus ; donc, que le test de controle contient le même "virus" que la culture initiale.

Mais, ce qui est intéressant, c'est la précision sur le fait qu'il y a "des différences significatives dans l'histoire et le mode de préparation des cultures de cellules H9 non infectées et "infectées". Ca veut dire que les deux cultures ne sont pas réalisées à l'identique. Et le fait de ne pas les faire à l'identique ça veut dire tout simplement qu'on triche sur la procédure.

Donc, ça va dans le sens de l'idée que soit on ne fait pas les tests de contrôle, soit, quand on les fait, on pratique des petites truandes qui vont donner le résultat voulu. Par exemple, on peut penser qu'il suffit d'obtenir des particules de taille virale dans le test de controle, mais avec un ARN ou des protéines de surface légèrement différents pour pouvoir dire qu'il n'y a pas "le" virus dans le test de controle. On va dire qu'il y a un virus dans le test de controle, mais comme ce n'est pas le même virus, on se fout de sa présence.

Bon, malgré la truande, on arrive quand même à prouver qu'il y a le même virus dans le test de controle que dans la culture intiale (celle avec le "virus"). Donc, la truande n'est pas forcément efficace. Mais pour un regard non averti, ça pourrait l'être. Et ce qui est important, c'est le fait qu'il y déjà eu au moins une truande de réalisée. Parce qu'alors, l'idée que soit on ne réalise pas le test de controle, soit on le truande, n'est plus une simple idée en l'air.

#7 aixur

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Posté 03 septembre 2005 - 10:22

Il y a une autre technique sympa (toujours dans l'article "le dernier débat", mais je n'avais pas tilté la première fois que je l'avais vu) : il y a exactement la même chose dans la culture de controle et dans la culture avec le "virus" ? Ben, tu déclares tout simplement que c'est différent. Cool hein ?

Elle est pas belle la vie des virologues ?

C'est ce qui s'est passé pour "l'isolement" du VIH de 1997.

#8 Cheminot

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Posté 03 septembre 2005 - 11:47

Les publis de Bess et de Gluschankof sont sur le site de healthtoronto

#9 aixur

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Posté 09 novembre 2005 - 23:08

Tiens, encore un truc qui va dans le sens de l'idée que les virus sont endogènes et produits par les cellules (trouvé dans la présentation d'Eleni Papadopulos de 1998 à la 12ème conférence sur le SIDA, page 15) :

"Dès 1976, l'éminent rétrovirologue George Todaro a écrit, "l'échec dans l'isolement des virus endogènes de certaines espèces pourrait refléter les limitations des techniques in vitro de cocultivation". En d'autres termes, avec suffisament de temps et d'ingéniosité, un chercheur peut produire des particules retrovirales à partir de n'importe quelle cellule".

Donc, en cultivant n'importe quelle cellule, on va trouver des particules de genre viral produites par les cellules elles-mêmes. Et on va trouver évidemment les mêmes dans la culture de controle (là où il y a des cellules sensées ne pas contenir de virus). D'ou la nécessité d'utiliser les techniques de truande décrites plus haut. Et d'où le fait que la truande se déplace sur le problème de la caractérisation du virus (ARN, ADN et protéines). On a des particules de genre virale dans les deux cultures (meme taille et même forme). Et du coup, on va truander sur le fait de savoir si elles sont différentes au niveau de leur ARN, ADN et protéines. Et vu que les méthodes de culture engendrent de vraies soupes, ça doit être assez facile de truander et de trouver de légères différences entre l'un et l'autre échantillon, ce qui permettra de dire qu'on n'est face à deux choses différentes. Ca permettra donc de dire que dans la culture de controle, on n'a pas trouvé de virus.

Selon moi, c'est normal de que dit Todaro, puisque les virus ne doivent être que des déchets du fonctionnement des cellules, voir de leur agression. Il est normal que toutes les cellules en produisent.

Au passage, en tombant sur un livre datant de 1945 et parlant des virus, il semble que la variole, l'herpès, l'encéphalite, la fièvre jaune, la grippe, la rage, la polio étaient considérées comme étant causées par des virus avant 1945 ; donc, avant la mise au point des méthodes d'isolement des virus. Donc, au moment où les méthodes d'isolement des virus ont été trouvées la messe était déjà dite : il y avait des virus. Avec les méthodes d'observation, d'isolement et de culture des virus nouvellement trouvées dans les années 40/50, Il fallait absolument qu'on trouve quelque chose allant dans ce sens. Il fallait trouver des virus. Donc, dès le départ il fallait truander, et dès le départ on a truandé. Il fallait assumer les conneries de la fin du XIXème siècle et du début du XXème (moment, si je me souviens bien, où on s'est dit que puisqu'on ne trouvait pas les bactéries causant la rage, l'herpès, la grippe, etc..., ce n'était pas que ces maladies n'étaient pas causées par des microbes, non non, mais qu'elles étaient simplement causées par des microbes plus petits).

Ce qui fait penser que le soi-disant "age d'or" de la virologie, situé vers les années 50/60, où les chercheurs étaient sérieux, honnêtes et droits, idée défendue par certains virologues dissidents (de Harven, Wilhelm sur AidsMyth Exposed), vraiment... grosse blague quoi. Il n'y a jamais eu de virologue sérieux, ni d'age d'or de la virologie. Au contraire, les années 50/60 sont très probablement celles où il y a eu la plus grande truande.

D'ailleurs, quand on lit le livre de Philippe Pignarre "le grande secret de l'industrie pharmaceutique", ce qui transparait, c'est que les années 50/60, c'était le far-west le plus total dans l'industrie pharamaceutique. On pouvait vraiment faire n'importe quoi, personne ne venait rien controler.

C'est sur qu'à l'époque, sans Internet, qui aurait pu avoir accès à ces travaux et controler le travail des virologues ? Personne. C'était complètement vérouillé et accessible uniquement aux spécialistes adoubés. Et même si par miracle, quelqu'un avait réussi à le faire, personne ne l'aurait écouté en dehors de cercles hyper restreints. Donc, ils devaient se sentir en totale sécurité pour faire leurs magouilles. Manque de bol, Internet est arrivé. Et des dizaines d'années de bidonnage remontent à la surface...

Modifié par aixur, 09 novembre 2005 - 23:29 .


#10 Cheminot

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Posté 09 novembre 2005 - 23:33

"La condition minimum, absolument nécessaire mais non suffisante, pour revendiquer que ce qui est appellé "des particules de VIH-1" est un retrovirus et pas des microvesicules cellulaires est de prouver que les fractions de densité de sucrose obtenues à partir des cellules "infectées" contiennent des protéines qui ne sont pas présentes dans les mêmes fractions obtenues à partir des cellules non infectées. Cependant, Bess et autres ont montré que ce n'est pas le cas. La seule différence qu'on peut voir dans leurs bandes d'électrophorèse de gel de SDS-polyacrylamide "de virus purifié" et de "faux virus" est quantitative, non qualitative. Cette différence quantitative peut être due à beaucoup de raisons, dont le fait qu'il y avait des différences significatives dans l'histoire et le mode de préparation des cultures de cellules H9 non infectées et "infectées"."


ce qui est intéressant dans cet avis d'Eleni Papadopoulos, et plus encore dans ce texte de Bess, c'est que la différence entre les protéines séparées par électrophorèse provenant du "virus purifié" et du "faux virus" n'est que quantitative, mais pas qualitative. Cela signifie qu'on retrouve en fait les mêmes protéines, mais en quantité différente. Cela rejoint ma remarque sur le fait que les tests "vih" ne sont pas des tests noir/blanc, mais des tests à limite.

Quels truands, ainsi que tu l'as déjà écrit!!!

#11 Guest_Daman_*

Guest_Daman_*
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Posté 09 novembre 2005 - 23:43

En somme, si je comprends bien, une trithérapie sert surtout à ramener la concorde entre trois laboratoires aux intérêts concurrents .

#12 aixur

aixur

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Posté 09 novembre 2005 - 23:52

(Cheminot @ Jeudi 10 Novembre 2005, 00:38)

ce qui est intéressant dans cet avis d'Eleni Papadopoulos, et plus encore dans ce texte de Bess, c'est que la différence entre les protéines séparées par électrophorèse provenant du "virus purifié" et du "faux virus" n'est que quantitative, mais pas qualitative. Cela signifie qu'on retrouve en fait les mêmes protéines, mais en quantité différente. Cela rejoint ma remarque sur le fait que les tests "vih" ne sont pas des tests noir/blanc, mais des tests à limite.

Quels truands, ainsi que tu l'as déjà écrit!!!


Eh oui, effectivement, on retrouve les mêmes protéines dans la culture ou est sensée se trouver le "virus" et dans la culture de controle, mais en un plus petites quantités dans la culture de controle. Effectivement, différence pas qualitative, mais juste quantitative. Ce qui va tout à fait dans le sens que les tests sont des tests à limite.

D'ailleurs, je n'y avais pas pensé, mais on peut probablement mettre ça en possibilité de truande pour la procédure d'isolement des virus. On a juste une différence quantitative et pas qualitative entre la culture ou est sensée se trouver le virus et celle de controle ? Ben pouf, ça veut dire qu'on n'a pas la même chose dans la culture de controle. Donc, pas de virus dans la culture de controle. Et voilà, on a satisfait à la procédure de controle sans se fatiguer.

#13 aixur

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Posté 16 décembre 2005 - 18:53

Je mets ma réponse à Nico111 tiré du topic "Tamiflu et grippe" ici. Ca me semble plus en rapport avec ce topic, même s'il s'agit d'un sujet qui est un peu différent. A mon avis, ça a rapport avec la critique que fait de Harven sur les nouvelles techniques d'isolement de virus utilisées depuis les années 70. Donc, c'est un peu différent de ce que je traitais au début (qui est plus basée sur la microscopie électronique, donc, sur ce qui se passait avant les années 70), mais ça rejoint le sujet de départ dans la mesure où on va pouvoir voir en quoi les cultures de controle actuelles sont foireuses elles-aussi. Et puis, c'est intéressant de rentrer dans le détail de la critique que faisait de Harven. En fait, ça va peut-être bien permettre d'avoir une vision plus large du problème.

Pour résumer, Nico111, biologiste travaillant sur un virus, obtient des choses différentes dans sa culture qui contient de l'ADN "viral" et sa culture de controle qui contient de l'ADN viral aussi, mais avec un des 8 ADN codant qui est différent. Donc, a priori, ADN qui est sensé être inactivé, si j'ai bien compris.

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Voici ce que fait Nico111 :

D'autre part dans le même style, j'ai des cellules en culture, je fait rentrer dans celles ci de l'ADN qui code pour le génome et les protéines de mon soi disant virus. en controle je prend ces mêmes cellules mais je ne met pas un des ADN codant pour son génome (par example pour la grippe il faut 8 ADN codant chacun pour un segment du génome). j'attend, entre trois jour et une semaine et je vois mes cellules qui progressivement sont détruites, le contrôle ne bouge pas. Ensuite, je purifie le tout pour enlever les cellules, je peux même faire une purification engradient de sucrose et je remet cela sur des cellules fraiches toujours avec le controle qui a subi les mêmes étapes. Rebelotte, en quelques jours mes cellules meurent. Par immunofluorescence, je vois les protéines de cet agent dans les cellules (rien en contrôle), je trouve son ARN par RT PCR (rien en contrôle). Je peux aussi piquer des souris (qui n'ont pas réçu de pain au chocolat ou du foie gras !) et elles développent la maladie (celles en contrôle n'ont rien). Etc.... si vous avez des idées de ce que cela pourrait être merci d'exposer vos idées car ça m'éviterait de continuer avec faire de la virologie comme un imbécile. Je précise bien sur que tout cela je l'ai fait avec mes petites mains et qu'on peut l'appliquer avec beaucoup de virus ou trucs de ce genre.


Donc, question de ma part sur le fait qu'il y ait eu un travail de purification et d'isolement de fait.

Aixur :
Ah oui, sinon, je crois voir ou est le truc. Tu vois les protéines par immunofluorescence dans les cellules. Mais, à la fin de l'expérience, est-ce que tu purifies et que tu essayes de caractériser les protéines trouvées dans la purification de la culture du virus et de la culture de controle ? Apparemment, ce n'est pas le cas.


Réponse de Nico111 :

Oui effectivement, je récupère le surnageant des deux et par exemple, je réinfecte des cellules alors je peux voir, l'effet sur les cellules, les protéines virales par immunofluorescnce ou western blot, détecter l'ARN par RT PCR et séquencer le génome. Je peux aussi le purifier en gradient de sucrose et je le retrouve majoritairement à la densité voulue etc..... Le fait de reconstituer ce type de virus a été très difficile à faire , tu penses bien que je réanalyse toujours le contrôle négatif pour être sure de ne pas avoir une contamination ou autre. Rien en contrôle ne donne tout ce que je t'ai dis. Je n'ai pas envi de passer pour un usurpateur auprès de mon chef, bonjour la réputation, comment se griller après s'être fait chier à faire un tas d'études et une thèse !


Ma réponse d'aujourd'hui :

Apparemment, l'analyse des composants du "virus" se fait quand les particules virales sont sensées être encore dans la cellule, pas quand elles sont dehors. Donc, oui, il y a eu purification de faite, mais pas sur l'étape dont je parlais. Ce n'est pas la purification servant à réinfection dont je parlais, mais de la purification des particules de taille virale servant de prélude à la caractérisation du virus. Donc, avant la caractérisation du virus, il n'y a pas de purification de faite apparemment (ou alors, une purification des cellules, pas du virus), et donc, toute la procédure de caractérisation des protéines et de l'ADN du virus se fait à partir d'une véritable soupe, pas à partir d'un truc où il n'y aurait que du virus (si tant est que ce soit possible d'obtenir ce genre de chose à partir d'une culture de cellule).

Est-ce qu'il y a une analyse au microscope électronique des deux cultures après purification des particules virales ? Ca m'étonnerais fort qu'on ne trouve pas de particules de tailles virales dans la culture de controle.

En ce qui concerne la méthode de caractérisation des protéines du virus, ça m'étonne que la culture de controle ne donne rien de similaire. Donc, soit la méthode de culture est différente (ce qui est possible vu la réaction des deux cultures), soit, il est possible aussi que ce soit du à ton interprétation du WB. Parce que, sur le WB comparant culture virale et culture de controle du VIH (Bess, 1997), tu nous disais que tu ne voyais rien dans la culture de controle. Alors que les dissidents eux, voyaient quelque chose. Donc, ton appréciation ne suffit pas, et j'aimerais bien voir les deux WB.

En ce qui concerne l'ADN et l'ARN, ils sont détectés par la PCR. Et la PCR, apparemment, en pratique, ça ne permet de dupliquer que des bouts d'ARN ou d'ADN. Donc, en aucun cas, ça ne permet de dire qu'on a détecté tel virus, puisque la séquence détectée, dans un tel bordel (je suppose que pour trouver l'ADN dans la cellule, il faut casser celle-ci en petit morceaux), peut être celle de n'importe quel bout d'ADN. Ca ne me semble pas très sage de déclarer qu'il y a différence entre les deux cultures, donc, de faire reposer tout le truc sur une technique si peu fiable, qui est connue, en plus pour donner des résultats très différents d'un test à l'autre.

Sinon, ce qui serait simple, c'est de nous donner la publication prouvant que le virus sur lequel tu travailles a été isolé. Si tu travailles sur ce virus, tu dois bien l'avoir le papier en question (si tu veux, tu peux me le communiquer en privé).

#14 Nico111

Nico111

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Posté 20 décembre 2005 - 16:42

Aixur ne lache jamais le morceau ! c'est bien mais j'ai peur qu'à la fin tu sois déçu ! Je vais essayer de te répondre mais on va devoir être un peu plus technique.


Pour résumer, Nico111, biologiste travaillant sur un virus, obtient des choses différentes dans sa culture qui contient de l'ADN "viral" et sa culture de controle qui contient de l'ADN viral aussi, mais avec un des 8 ADN codant qui est différent. Donc, a priori, ADN qui est sensé être inactivé, si j'ai bien compris.


C'est ......ça oui . Pour préciser, 8 segments ça correspond à la grippe mais c'est moins de segments mais ça revient au même, même principe. De plus ce sont des virus à ARN , pas à ADN mais afin de faire exprimer ces ARN viraux dans les cellules on fait rentrer dans les cellules des ADN (appelés plasmides ) qui vont exprimer ces ARN après transcription. Don con peut refaire du virus si on apporte les ADN codant pour le génome viral et codant aussi pour les protéines virales indispensables. Si on omet ou si un des ADN qui doit exprimer un des segments d'ARN ne code pour rien alors pas de virus. La technique c'est celle là développée pour Bunyamwera (proche de mon virus) et je précise que je l'ai expérimentée moi même :
Lowen AC, Noonan C, McLees A, Elliott RM. Related Articles, Links
Abstract Efficient bunyavirus rescue from cloned cDNA.
Virology. 2004 Dec 20;330(2):493-500.


Ce n'est pas la purification servant à réinfection dont je parlais, mais de la purification des particules de taille virale servant de prélude à la caractérisation du virus. Donc, avant la caractérisation du virus, il n'y a pas de purification de faite apparemment (ou alors, une purification des cellules, pas du virus), et donc, toute la procédure de caractérisation des protéines et de l'ADN du virus se fait à partir d'une véritable soupe, pas à partir d'un truc où il n'y aurait que du virus (si tant est que ce soit possible d'obtenir ce genre de chose à partir d'une culture de cellule).


Non je ne fais pas après avoir reconstitué par cette technique du virus , d'étude en microscopie éléctronique pour le fait d'abord que c'est super lour et chère et que surtout une fois les anticorps spécifiques préparés et qui marchent en WB, ELISA , Immunofluorescence et que on a les séquences pour amplifier le génome par RT PCR on n'a plus besion de faire de microscopie à part si bien sur on étudie quelque chose qui le nécessite comme la maturation et la sortie du virus (voir la référence que je te donne sur Bunyamwera et sa maturation qui est gratos à lire ). Les papiers de caractérisation du virus sont archi vieux faut que je regarde mais regarde Bunyamwera , moi c'est proche : Salanueva IJ, Novoa RR, Cabezas P, Lopez-Iglesias C, Carrascosa JL, Elliott RM, Risco C. Related Articles, Links
Free in PMC Polymorphism and structural maturation of bunyamwera virus in Golgi and post-Golgi compartments.
J Virol. 2003 Jan;77(2):1368-81.
Les images sont chouettes.

effectivement quand je refais du virus par cette technique, j'ai une soupe au départ mais j'ai plein de technique pour l'isoler et le caractériser : WB, ELISA, immunofluorescnce, observation de l'effet délètere pour la cellule avec un simple microscope (les cellules se mettent en suspension et s'arrondissent) , RT PCR etc....Ca suppose bien sur qu'au départ on a bien isolé le virus et caractérisé ses protéines et pas celles cellulaires mais les contrôles cellulaires sont là et pour moi c'est clair: tout est négatif en contrôle.


Est-ce qu'il y a une analyse au microscope électronique des deux cultures après purification des particules virales ? Ca m'étonnerais fort qu'on ne trouve pas de particules de tailles virales dans la culture de controle.


Non mais tous les tests cités au dessus sont négatifs en contrôle.

En ce qui concerne la méthode de caractérisation des protéines du virus, ça m'étonne que la culture de controle ne donne rien de similaire. Donc, soit la méthode de culture est différente (ce qui est possible vu la réaction des deux cultures)


Non la seule différence c'est que un des ADN code pour rien tout le reste est strictement identique.

soit, il est possible aussi que ce soit du à ton interprétation du WB. Parce que, sur le WB comparant culture virale et culture de controle du VIH (Bess, 1997), tu nous disais que tu ne voyais rien dans la culture de controle. Alors que les dissidents eux, voyaient quelque chose. Donc, ton appréciation ne suffit pas, et j'aimerais bien voir les deux WB.


Attention tu interprêtes mal ce que j'ai dit : Sur ce fameux gel TOUTES les protéines sont révelées par un réactif spécifiques des protéines (en pratique seules les protéines présentes en grande quantité sont détectées) MAIS ce n'est pas SPECIFIQUE D'UNE SEULE PROTEINE. Donc qu'est ce qui te permet de dire que les 3 bandes qui migrent à des poids moléculaires de 24 et X et Y sont bien les protéines virales ???? Rien . Mais d'autre part qu'est ce qui te permet de dire que ces 3 bandes sont présentes en faible quantité dans le contrôle car c'est n'est pas SPECIFIQUE. Tu as plein de protéines partout. Ma seule conlusion c'est : dans les puits infectés , on a 3 protéines qui sont présentes en grande quantité , un point c'est tout. Impossible de faire ire plus tant que l'on ne fait pas un WB avec es anticorps spécifiques , c'est ce que demandait le groupe de Perth. Mais affirmer seulement à partir de ce gel que ces 3 bandes sont aussi présentes dans le contrôle est faux archi faux car tu ne peux identifier aucune protéine.
Je n'ai pas de WB sous la main comme ça mais voilà une immunofluorescence avec des anticorps spécifiques contre la nucléoprotéine virale : d'abord le contrôle négatif : pas de fluorescence verte (les cellules sont marquées en rouge)

Image IPB

puis la culture avec virus : tout vert:
Image IPB



En ce qui concerne l'ADN et l'ARN, ils sont détectés par la PCR. Et la PCR, apparemment, en pratique, ça ne permet de dupliquer que des bouts d'ARN ou d'ADN. Donc, en aucun cas, ça ne permet de dire qu'on a détecté tel virus, puisque la séquence détectée, dans un tel bordel (je suppose que pour trouver l'ADN dans la cellule, il faut casser celle-ci en petit morceaux), peut être celle de n'importe quel bout d'ADN. Ca ne me semble pas très sage de déclarer qu'il y a différence entre les deux cultures, donc, de faire reposer tout le truc sur une technique si peu fiable, qui est connue, en plus pour donner des résultats très différents d'un test à l'autre.


Non non non la technique de RT PCR est extrêment fiable mais comme toute technique il faut employer les bonnes conditions. En utilise pour amplifier les ARN viraux des petit morceaux d'ADN (appelés amorces) qui s'hybrident à l'ARN viral. En général 14 nucléotides c'est suffisant. Ensuite on fait la RT-PCR avec deux amorces spécifiques (si elles ne le sont pas forcément tu détecteras des bandes dans le contrôle ou tu n'aura rien). Et dans toute cette soupe bien sur que j'ai des choses spécifiques qui ne sortent que quand c'est infecté. Je peux même amplifier un segment viral en entier (un fait plus de 6000 nucléotides) en une seule fois. Bien sur on utilise les paramêtres qu'il faut comme une température d'hybridation pendant la PCR telle que seule l'amorce peut hybrider à ces ARN. Je ne détaille pas car ç'est compliqué quand on ne connait pas mais si tu veux de détails. En tout cas cette technique est hyper fiable, tout comme le WB, ELISA etc.....le problème c'est si au départ ce que tu as utilisé pour faire les anticorps et ce que tu as séquencé c'est bien du virus et pas quelque chose de la cellules. Les contrôles sont là pour ça.

#15 aixur

aixur

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Posté 13 avril 2006 - 09:50

Juste vite fait une pensée sur un truc que je voulais écrire depuis pas mal de temps (depuis à peu près mes dernières interventions sur ce topic, donc novembre ou décembre environ).

En lisant des documents sur le sujet, et spécialement ceux de Etienne de Harven, à mon avis, il y a un problème dans chacune des deux techniques d'isolement (la méthode par microscopie électronique et celle par techniques chimiques). La technique visuelle, par microscopie électronique pose le problème des particules de taille virale qui sont produites dans l'échantillon de controle. Et la technique chimique est entachée de multiples biais qui la rendent non valide elle aussi.

Or, il semble que les deux techniques ne se sont jamais rencontrées. Je veux dire par là qu'elles n'ont probablement jamais été utilisées ensembles. Jusqu'au début des années 70 (ou environ), on n'avait pas encore les techniques chimiques permettant de caractériser les virus. Et à partir du début des années 70, on a du commencer à utiliser les techniques chimiques en arrêtant d'utiliser la microscopie électronique. Bref, il n'y a jamais eu d'utilisation conjointe des deux techniques, utilisation conjointe qui aurait pu permettre d'avoir des isolements moins bidonnés. Résultat, probablement qu'aucun virus n'a pu être isolé correctement.

Bien sur, les études faites après les travaux d'isolement n'ont pas de valeur, puisqu'elles ne reprennent que certaines des techniques et procédures utilisées lors de l'isolement.

PS : Et tout ça, sans même évoquer les virus "isolés" avant les années 40, bien sur.

#16 Nico111

Nico111

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Posté 13 avril 2006 - 10:10

La technique visuelle, par microscopie électronique pose le problème des particules de taille virale qui sont produites dans l'échantillon de controle.


Mouais, à la rigueur pour les rétrovirus et plus particulièrement le vih mais cette publi :
Briggs JA, Grunewald K, Glass B, Forster F, Krausslich HG, Fuller SD. Related Articles, Links
Abstract The Mechanism of HIV-1 core assembly: insights from three-dimensional reconstructions of authentic virions.
Structure. 2006 Jan;14(1):15-20.
PMID: 16407061 [PubMed - in process]

donne des virions sans vésicules contaminantes.

Et la technique chimique est entachée de multiples biais qui la rendent non valide elle aussi.


J'ai hate d'entendre les arguments.

Au dela de ça j'aimerais que tout cela ne soit pas focalisé uniquement sur les rétrovirus et les problèmes spécifiques à cette famille, il y a plein de virus qui répondent à ce tant aimé postulat de Koch etc....J'espère pouvoir continuer à dicuter et répondre à tout cela dans 2 semaines.

#17 Irewiss

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Posté 13 avril 2006 - 11:54

Pour faire court est-ce qu'on a déjà pu observer de façon claire et sans aucun doute le virus du sida au microscope à balayage élèctronique ?

oui / non ? icon_razz.gif

#18 Cheminot

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Posté 13 avril 2006 - 12:57

En 2006 seulement, on a pu, à partir de ce qu'on appelle les clones du vih, faire apparaître des virions visibles au microscope électronique. Mais sont-ils infectieux?

#19 diamant bleue

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    poufpouf.... ça sera toi qui....

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Posté 13 avril 2006 - 14:14

(Irewiss @ Jeudi 13 Avril 2006 à 11h34)
Pour faire court est-ce qu'on a déjà pu observer de façon claire et sans aucun doute le virus du sida au microscope à balayage élèctronique ?

oui / non ? Image IPB


Meme si la réponse à ta question peut etre "oui" elle ne te sert à rien Image IPB
On peut cultiver en labo a peu près tout et n'importe quoi, particulièrement les virus qui sont des bouts d'ADN qu'on peut "agencer" en labo pour produire tout et n'importe... Produire ne veut pas dire que cela existe dans la nature et que c'est "viable".

Par contre à la question : est-ce qu'on a déjà pu observer de façon claire et sans aucun doute le virus du sida au microscope à balayage élèctronique dans le sang d'un séropositif ? Là, la réponse est non.

C'est une des raisons qui fait que les détracteurs du HIV (et non du SIDA) disent que la soit disant découverte du HIV ne répond pas au prootocole de Koch qui défini un certain nombre de règles pour l'isolation des virus, microbes et autres bestioles Image IPB

#20 Nico111

Nico111

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Posté 13 avril 2006 - 15:24

POur ceux que ça motive un article très intéressant où ils font de la microscopie éléctronique" directement " avec des echantillons de patients : trachée pour grippe, urine pour CMV etc....

Johnsen CK, Bottiger B, Blom J. Related Articles, Links
Abstract Confirmation of electron microscopy results by direct testing of viruses adhered to grids using nucleic acid amplification techniques.
J Virol Methods. 2006 Jan 14; [Epub ahead of print]




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